的分离培养和人工重建.ppt

第三章 地衣共生菌藻的分离、培养和人工重建 地衣是否能分为单个生物 不同有机组织的相互关系 更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题 次生代谢物的研究 一、共生真菌的分离和培养 1、地衣型真菌常用的培养基 2、子囊孢子释放法 3、组织培养法 4、培养共生菌的保存 1、地衣型真菌常用的培养基 WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基 琼脂 4g 蒸馏水补足100ml MY培养基——麦芽酵母提取物培养基 麦芽提取物 20g / 酵母提取物 2g / 琼脂20g / 蒸馏水补足1000ml LB培养基——Lilly and Barnett’ s培养基 葡萄糖10g / 天冬酰胺酸2g / KH2PO4 1g / MgSO4?7H2O 0.5g / Fe(NO3)3?9H2O 0.2 mg / ZnSO4?7H2O 0.2mg / MnSO4?4H2O 0.1mg / 维生素B1 0.1mg / 维生素H 5ug / 蒸馏水补足100ml 可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足 1000ml，并制成固体培养基。 LBG 培养基——Lilly and barnett gelrite 培养基 LB培养基中以1%的Gelrite 代替琼脂。 注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前应将所有培养基进行灭菌。 4、培养共生菌的保存 共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）。 通常共生菌在15~20℃时表现出最大生长率。每种均有其最适生长PH值，通常PH范围为5~6。太高或太低的PH均会阻碍其生长。 在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。 地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。 二、共生藻及蓝细菌的分离和培养 1、培养基 2、培养前处理 3、共生藻的培养 4、无菌培养群体的分离 5、共生藻培养的保存 1、培养基 BBM培养基——Bold’s Basal Medium 3× N BBM培养基 Trebouxia培养基 MDM培养基 2、培养前处理 1）清洗 对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约1㎝2，然后放在自来水中浸泡5~10分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。 对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入装有1~2 ml的无菌水和一滴Tween－20的小试管中。超声波粉碎约3分钟。离心去除地衣体表面的附属物。 2）地衣体匀浆液的制备 大型地衣（枝状或叶状）： （1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。 （2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。 （3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。 （4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。 较小地衣体： 清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。 3、共生藻的培养 含共生藻的悬浊液 15天培养：15～20℃ 共生藻群（1个月左右） 要注意藻的污染 4、无菌培养群体的分离 直接挑选法：体视显微镜 喷雾法 微量吸管吸法 离心法 5、共生藻培养的保存 在低光照的条件下，可以培养很长一段时间 （约1年） 。最好每2~3个月传代一次。大多数的地衣共生藻的最佳生长温度为15~20℃。其生长的最佳pH范围是4~7。 （1）用解剖刀将带有琼脂培养基的共生藻群体分为几部分（约５mm2），将群体放在有合适培养基的皮氏培养皿中培养2-3个月. （2） 每2-3个月将生长的群体转移到相同成分的新鲜培养基上，在相同的条件下培养。地衣共生藻也可以在液氮下冷冻保藏相当长的时间仍保持活性。 三、地衣菌、藻共生的人工重建 Stocker-W?rg?tter（1994） 地衣体人工重建的基本操作步骤如下： （1）收集你想重建的地衣（如Peltigera aphthosa）基物处的土壤。 （2）用筛孔约1~2mm的筛子将500g土壤过筛，然后在其中加入100ml的二次蒸馏水。 （3）将湿的土壤放入100×15mm的玻璃皮氏皿中，填充高度为8mm。对其进行高压灭菌后放置24小时，然后再次高压灭菌。 （4）用无菌培养的共生绿藻和蓝细菌对土壤进行接种，然后