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氨基酸的紫外-可见光谱分析 Ultraviolet-Visible Spectroscopy Analysis of Amino Acids 姓名：吉武良：化院：P：Abstract：Ultraviolet-visible spectroscopy analysis is an absorption spectroscopy based on molecular electronic transitions.It is used to qualitatively and quantitatively analyze conjugated organics,as well as inorganic compounds with electronic transitions or transition metal ions. This experiment is designed in the example of UV-Vis analysis of aromatic amino acids,that is Phenylalanine,Tyrosine and Tryptophan, to learn principle of UV-vis analysis,operation of UV-Vis spectrometer and approach to qualitatively and quantitatively analyze. Key words：Ultraviolet-visible spectroscopy analysis,Phenylalanine,Tyrosine Tryptophan,Amino acid, Qualitative,Quantitative. 一、 二、 （Ⅱ）仪器： UV-VIS-NIR Spectrophotometer(UV-3600,SHIMADZU); 0.5mL、1.0mL、2.0mL移液管若干； 10mL带塞比色管若干。 （Ⅲ）实验步骤 （1）分别移取标准溶液(a)（2.0 g/L，1.0 mL）、标准溶液(b)（0.4 g/L，1 mL）和标准溶液(c)（0.4 g/L，0.4 mL）标准溶液于10 mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用。 分别移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0 mL标准溶液（b）于5个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。 双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。 在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在200～350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax 。 在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度。 在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。 、 Figure 4：氨基酸定性分析吸收光谱 （2） Figure 5：色氨酸定量分析 2、讨论 定性分析： 由图4可知：苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸吸收峰波长依次增大，摩尔吸光系数依次增大。解释如下： 在紫外-可见光区域内能发生跃迁的原子团叫生色团，如各种不饱和键，而且吸收峰波长和摩尔吸光系数随共轭程度增加而增大。 不能发生跃迁但和生色团相连可以增大吸收峰波长，增强吸收强度的原子团叫助色团，如羟基，氨基，烷氧基，巯基，卤素等。 由此可知：酪氨酸因为有羟基，色氨酸因为有吡咯环存在，吸收峰波长和摩尔吸光系数增大。 定量分析： 对于单组分物质，定量分析可以做出吸光度-浓度曲线求未知样。但对于混合物，如果各组分吸收相干扰，就要想办法消除。 实验中酪氨酸和色氨酸吸收峰接近，干扰严重，不能简单计算。常用的方法是导数分光光度法，其原理为： 根据Lambert-Beer定律，吸光度是波长函数 将吸光度对波长求导，得 吸光度各阶导数仍与浓度成正比，所以可以用于定量分析。 做法为：对待测组分和干扰吸收曲线求各阶导数，找出待测物峰值出现在干扰物为零的阶，利用该阶导数定量分析。 以下为色氨酸和酪氨酸1至4阶导数图像： Figure 6：酪氨酸和色氨酸吸收曲线各阶导数 由上图可知，二阶导数在230nm左右时，酪氨酸吸收为0，色氨酸吸收最大，故可以选择二阶导数。对图5求二阶导数，图像如下： Figure 7：定量分析吸收曲线二阶导数 由图中数据，做出工作曲线如下图： Figure8：色氨酸工作曲线 由拟合报告知： 未知样吸光度为0.030，则 故未知样浓度 四、思考题 长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么？