基于DArT技术的杜仲遗传多样性及基因型识别研究-扬州大学.doc

开题报告 基于DArT技术的杜仲遗传多样性及基因型识别研究 姓名：洪义欢 学号：D08034 导师：陈建民教授 摘要：杜仲为单科属种植物，具降压、利尿等药用价值。目前野生杜仲种群资源非常稀少，其遗传多样性及基因型识别方面的研究仍处于较低级的水平。采用DArT方法（diversity arrays technology）对不同地区的杜仲进行遗传多样性的分析，即通过将基因组DNA酶切片段连接到载体上并转化获得转化子，再通过杂交选择和基因微阵列的技术方法分析杜仲在不同居群内部及居群间的遗传分化情况，为杜仲种质资源的遗传多样性及保护提供基础资料和对策。将筛选得到的多态性的克隆转化子进行测序并转化为依赖于PCR的具多态性的分子标记，对不同居群的杜仲基因组DNA进行扩增比较条带差异，为栽培杜仲的基因型鉴定提供分子标记。利用光镜和电镜对杜仲叶片和花粉进行显微和亚显微形态观察，结合多态性分子标记将不同产地杜仲进行科学分组，为优良杜仲群体的扩繁和遗传改良提供重要的参考作用。 关键词：杜仲；遗传多样性；DArT；基因型 （一）研究杜仲(Eucommia ulmoides Oliv) 又名丝连皮、扯丝皮、丝棉皮、玉丝皮、思仲等，为杜仲科落叶乔木，我国特有的第三纪孑遗植物，单科目单种属植物，雌雄异株，异花授粉，分布于秦岭以南的陕西、四川、贵州、湖北、湖南等省，为国家二级珍贵保护树种。根据自然地理特点及其经济性状和形态特征的差异，将杜仲分为7个分布区，即秦巴山区大娄山区，鄂西山区，武陵山区，伏牛山－桐柏山－大别山区，浙、赣、皖交界山区，南岭山区，地理区域的生物学特性的差别不明显，因此认为不能根据生物学特性按地理区域进行分组。杜仲是雌雄异株，异花授粉，长期采用天然杂交的种子繁殖，加上不同地理环境的长期栽培，产生了地理生态变异。有人依树皮的特征将杜仲分为4个变异类型，即深纵裂浅纵裂、龟裂和光皮。也有人根据叶片形态特征分为长叶柄杜仲、小叶杜仲、紫红叶杜仲等，也有人根据枝条、果实的特征分成若干类型。事实上这些分类标准受杜仲生长环境的影响根大，如土壤类型、降雨量、相对湿度、温度日照等，在实际应用中很难准确掌握。杜仲树皮自古便以名贵药材而著称具有明显的降压、等药用价值作为一种重要的经济树种收获方式砍伐剥皮造成杜仲资源的严重破坏。保护杜仲资源选择药用成分含量高、含胶量高、产皮量高、速生的优良树种尤为重要。通过表现型观测也选择了一些优良树种，但从真正意义的遗传育种来说还相差甚远。杜仲作为稀有的重要经济植物需要加以保护和研究利用，然而，杜仲的野生资源难以发现，在我国又分布于不同的省份，研究者依据不同形态特征或地理区域而将我国分布的杜仲分成若干类型，这些形态上的差异是由于生态条件造成的还是遗传性所决定的，目前还不知道，因为人们对杜仲的遗传多样性还不清楚。利用现代分子生物学方法对杜仲的遗传多样性进行分析，将有利于杜仲优良树种的选择、资源保护和开发利用相比于其他植物的遗传多样性研究，现代分子生物学方法杜仲遗传多样性研究还处于非常低级的水平。依赖于芯片杂交为基础发展起来的DArT（iversity arrays technology）技术应用了微阵列平台技术相关原理，在大麦、小麦等遗传多样性和遗传图谱研究中已得到应用。(/forge/entry.jspa?entryID=51)与其它分子标记技术相比较具有高通量的特点，一个阵列可同时检测发布在基因组中的几百个多态性位点；不需要预先知道DNA序列信息，尤其对于亲缘关系稀少的材料该技术更具有适用性；该技术重复性稳定，实验可靠，受染色体倍数性和基因组大小的影响很小；由该技术揭示的遗传多态性还可进行克隆而发展为新的标记，而且标记发现和标记评价是在同一芯片上进行，无需发展进一步的评价体系而表现低成本等优点，因此将其应用到药用价值极高的独种属材料－杜仲。从DNA水平上揭示杜仲的遗传多样性，对研究杜仲的遗传变异、杜仲的演变进化、杜仲栽培类型的分组、杜仲种质资源开发与利用、确定杜仲核心种质并保存、进行杂交育种的亲本选配等均具有重要意义。 研究目标、研究内容, 以及拟解决的关键问题研究目标（1）采用DArT方法对不同的杜仲进行遗传多样性的分析，通过杂交选择和基因微阵列的技术方法分析内部及间的遗传分化情况，为杜仲种质资源的遗传多样性保护提供基础资料获得具有多态性的对不同的杜仲基因组DNA进行扩增比较条带差异，为进一步选育杜仲优良品种提供遗传基础。研究内容 利用DArT方法获得具有多态性的分子标记 1） 基因组DNA的限制性酶切片段的克隆 选取10个比较有代表的地区或表型杜仲为材料提取基因组DNA，基因组DNA的提取方法采用改进的CTAB法，取10杜仲基因组DNA混池，降低复杂性， 多样性微阵列的制作 利用接头相匹配的引物