葡萄内生菌中耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选与鉴定-石河子大学.doc

葡萄内生菌中耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选与鉴定 石河子大学 杨杰，马蕊洁，吕秋歌，唐鹏科，刘娅 （石河子大学食品学院 新疆石河子市 832000） 指导教师 刘娅副教授 摘要：为适应非水相酶学对脂肪酶耐有机溶剂性能的特殊要求，挖掘更多耐有机溶剂脂肪酶产生菌，首先针对葡萄内生菌，罗丹明B平板法初筛8株产脂肪酶以1%正庚烷、1%甲苯为压力和遗传稳定性，耐有机溶剂脂肪酶的CJ。通过形态及26SrDNA-ITS分子鉴定，确定菌株CJ为黑曲霉（Aspergillus niger）。异丙醇、异辛烷、正庚烷对酶活力有促进作用，乙醇及正丁醇对酶活力有很强的抑制作用Abstract: To get more microbe with the ability of solvent tolerant lipase，73 endophytes from grape were selected as start strains. Firstly, 8 strains of lipase secretion were screened by rhodamine B mechod.Then a target strain named CJ was ioslated by 1% n-heptane and 1% methylbenzene as selection pressure.Morphology and 26SrDNA-ITS identified that CJ was Aspergillus niger .At last, solvent tolertant experiments were conducted to learn the ability of lipaes from CJ,which indicated that the lipase had wide range of solvent tolerance capability,lipase activity were greatly improved in the solvent of isopropanol,isooctane and n-heptane, while its activity were obviously inhibited in the solvent of ethanol and n-butanol.The research provied good microbal resource for aromatic ester synthesis in the field of food industry and biodegradation solvent in environment. Keywords: Endophytes; Solvent tolerant lipase; Screening; Identification 一、引言 随着非水相酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了油-水界面上进行水解反应的范围，如食品工业的油脂改性、香精香料工业的芳香酯合成、医药行业的手性化合物拆分、肽合成、生物能源行业酶法合成生物柴油等反应体系中，脂肪酶底物是水不溶性的，或者在水中不稳定，加之天然酶在有机相中容易发生结构重排而降解失活，因此在非水介质中的脂肪酶催化反应成了该领域的重要突破口[1-3]。固定化、化学或物理修饰、反胶束体系包埋、基因工程、蛋白质工程等对脂肪酶分子的改性方法虽然可在一定程度上提高酶活和使用寿命，但效果却不显著[4]。由于微生物是当前工业脂肪酶的最重要来源[5]，因此从微生物中探寻天然具有有机溶剂耐受性能的脂肪酶势在必行。 第一作者简介：杨杰（1991-），男，新疆人，食品科学与工程专业，2010级，食品生物技术方向 指导教师简介：刘娅（1974 -），女，四川人，副教授，硕士生导师，主要从事食品生物技术等研究。 目前，从自然界分离到的能产耐有机溶剂脂肪酶的菌种相对较少，远不能满足诸多非水相体系对脂肪酶的要求，因此有必要拓宽相应的菌种来源。现有研究表明，植物内生菌中酶资源丰富，是潜力巨大的生物催化剂宝库，大多数内生菌能产常见的脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等，某些内生菌还能产生一些新的酶类（降解菲、聚酯等）[]，因此有望从内生菌中获得耐有机溶剂脂肪酶产生菌。为挖掘更多耐有机溶剂极端微生物，课题组针对葡萄中分离的73株内生菌，从中筛选耐有机溶剂脂肪酶产生菌，确定其分类学地位，初步了解其有机溶剂耐受性，从而为耐有机溶剂脂肪酶在食品工业和环保领域的应用及其酶学特性研究奠定基础。 二、材料与方法 （一）实验材料和试剂 1.供试菌株 葡萄内生菌：本实验室自行分离，来自葡萄。2.实验试剂 橄榄油罗丹明B聚乙烯醇对硝基