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内容简介 一、基本原理 二、化学原理 三、技术应用 四、实时定量PCR概述 一、基本原理 什么是Real-time PCR? Real-time PCR是如何实现的? 传统PCR 具有以下基本要素dsDNADNA模版, primers引物, dNTPs核苷酸, PCR buffer缓冲液, Taq polymeraseDNA聚合酶等 Real-time PCR是如何实现的? 在控温模块（Temperature Block）上实现循环反应 Denaturating of template（模板变性） Annealing of oligos（引物退火） Extension of primers to make new products （序列扩增） Real-time PCR是如何实现的? 在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence） Real-time PCR是如何实现的? Real-Time PCR仪包括thermal block控制温度, halogen lamp 激发荧光, filters, 和 CCD camera检测信号 Real-time PCR是如何实现的? Real-time PCR是如何实现的? Real-time PCR是如何实现的? 最后, real-time软件会对采集到的数据进行分析 二、化学原理 支持的化学试剂 TaqMan? 化学原理 (又称 5’-Nuclease ) TaqMan? 中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物 第三段短片段序列，又称为探针, 位于序列中间 探针标记两种 染料分子 完整的探针 然而，如果探针断裂了…… TaqMan? 进行中…… Denaturation变性 (95oC) Taq酶登场…… 找到引物序列…… 开始延伸 (60oC) Extension延伸 (60oC) Extension延伸 (60oC) Extension延伸 (60oC) Taq酶很特别…… 具有核酸外切酶活性， 可以‘吃掉’结合到模板上 的DNA片段 Taq酶降解探针 Taq酶降解探针 Taq酶降解探针 每个循环之后 理论上，反应管里的目标片断数会加倍。 报告荧光信号相应成比例增长。 Real-Time 扩增检测 ABI 7500 TaqMan? 荧光染料选择 SYBR? Green I 染料 SYBR? Green I 染料 SYBR? Green I 染料 SYBR? Green I 染料的缺点 使用 Melt curve (Dissociation Curve)检查反应特异性 Melt curve: 导数图谱 Melt curve的杂峰 到底用哪一种化学方法呢？ TaqMan?, 还是 . . . SYBR? Green I? 优点 更高的特异性 不会有引物二聚体干扰 支持多重荧光实验设计 实验方法易于优化 缺点 价格稍贵 优点 价格便宜 大部分基因以及少量样品均适用 缺点 特异性稍差 必须要做 Melt curves 不支持多重荧光设计 实验方法通常需要优化 三、技术应用 AB 支持3种技术应用 终点检测 vs. 实时检测 End-point 方法 不需要实时数据收集 – 只需要2分钟样品扫描。 不是定量实验，是定性实验。 可以在普通PCR仪上完成扩增。 终点检测 vs. 实时检测 Real-time 方法 使用实时定量PCR仪，在每个循环后采集数据。 任何定量实验所必须的。 四、实时定量PCR概述 PCR 有三个显著阶段 几何级数扩增期 (常称 对数 或 指数 扩增期) 线形扩增期 平台期 PCR的三个阶段 PCR的三个阶段 PCR的三个阶段 定量实验 只有一个扩增期提供高质量的数据 1: 重复性 2: 准确性 3: 动态范围 指数/对数扩增期 指数/对数扩增期 ? 好！ 线形扩增期 ? 不太好！ 平台期 ? 差！ Real-Time PCR 专用术语及分析 Baseline 基线 如何设置 baselines? 如何设置 baselines? 可以使用 Auto Baseline 设置 Auto baseline 每个样品单独设置基线。 可以使每个样品拥有 “完美” 基线。 可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。 Auto Baseline 会失败吗? 会 . . . 某些样品的Baseline会很短，出现S型弯曲。 Threshold 阈值 在哪里设置阈值? 软件默认 Auto Threshold Auto Threshold 自动阈值 对于不同的批次的实验，软件单独设置阈值 因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期 Cycle threshold (又称 Ct) 如何手动分析得到Ct 基线决定阈值 L