1种简单有效的根际土壤微生物DNA提取方法.PDF

江苏农业科学　２０１７年第４５卷第４期 — ３９— 郑道君，张冬明，吉清妹，等．１种简单有效的根际土壤微生物ＤＮＡ提取方法［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（４）：３９－４０，６９． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．０４．０１１ １种简单有效的根际土壤微生物 ＤＮＡ提取方法 １，２ １ １ ２ １ 郑道君 ，张冬明 ，吉清妹 ，史珍萍 ，符传良 （１．海南省农业科学院农业环境与土壤研究所，海南海口５７１１００；２．海南省农业科学院热带园艺研究所，海南海口５７１１００） 　　摘要：研究了１种快速简便地提取高质量根际土壤ＤＮＡ的改良十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法，应用该方法能 简便快速地去除腐殖酸等干扰物质，从而获得高质量的根际土壤 ＤＮＡ。所得 ＤＮＡ的Ｄ ／Ｄ 值为 １．４７７± ２６０ｎｍ ２３０ｎｍ ０１２１，以此ＤＮＡ为模板，可以获得带条清晰、重复性高的相关序列扩增多态性ＰＣＲ（ＳＲＡＰ－ＰＣＲ）扩增结果。 　　关键词：根际土壤；ＤＮＡ提取；改良ＣＴＡＢ法；相关序列扩增多态性ＰＣＲ（ＳＲＡＰ－ＰＣＲ） 　　中图分类号：Ｓ１５４．３４　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１７）０４－００３９－０２ 　　通过传统分离方法获得并进行过研究的微生物种群数量 １．２．２　主要仪器　台式高速冷冻离心机；温水浴锅；制冰机； 只占自然界微生物总数的１％［１－２］，因此，采用培养的方法很 移液枪；紫外分光光度计；Ｔ１００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ型ＰＣＲ仪（美 难真实地反映土壤微生物的变化。近年来，不依赖于培养，直 国Ｂｉｏ－Ｒａｄ）；水平电泳仪；凝胶成像系统等。 接从土壤中提取微生物总ＤＮＡ进行分析的一系列分子生态 １．３　试验方法 学研究技术因其研究结果具有快速、准确、全面等特点，被广 １．３．１　取样及样品前处理　（１）带土挖出整株植物的根系， 泛应用于土壤微生物群落结构、功能及动态监测等方面的研 挖出时尽可能多带些土；（２）轻轻抖去根系上大块的土壤，剪 ［３］ 究 。通过这些分子生态学技术，土壤不再是黑箱，而是可 取约１５ｇ的带土根系，置于装有灭菌的０．８６％ ＮａＣｌ溶液的 以看得见、摸得着的系统，使得许多年以来土壤微生物学家所 ２５ｍＬ离心管中，并快速带回实验室；（３）将上述离心管放在 面临的诸多问题可以得到解决。ＤＮＡ的分离提取是分子生 冰中３０ｍｉｎ，每隔５ｍｉｎ取出摇匀 １次；（４）去掉植株根系， 物学研究中重要的基本技术，从不同土壤中提取分离获得纯 ４０００ｇ、４℃低温离心３０ｍｉｎ，然后去除上清液。将所得土壤 度较高的土壤ＤＮＡ是进行土壤微生物分子生态学研究的前 沉淀物保存于－２０℃备用。 提。本研究探索了１种简单高效提取根际土壤 ＤＮＡ的改良 １．３．２　土壤总ＤＮＡ的提取　（１）取上述土壤样品约 １．０ｇ 十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法。 于２．０ｍＬ离心管中，置于液氮中３ｍｉｎ，再放入６５℃水浴锅 中解冻２ｍｉｎ，反复进行３次；然后在高通量组织研磨仪上用 １　材料与方法 液氮研磨１ｍｉｎ，至粉未状。（２）立即将上述粉末转入６５℃ １．１　材料 预热的８００ Ｌ３×ＣＴＡＢ提取液［１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ μ 土壤为取自海南省农业科学院农业环境与土壤研究所大