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广州维伯鑫生物科技限公司 GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY CO., LTD 蛋白质双向电泳及质谱技术 夏欢 广州维伯鑫生物科技有限公司 技术服务部 2014.10.08 蛋白质组学应用领域 信号通路研究 研究细胞结构功能和分子组成 发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物 研究药物作用方式和毒性机理及其耐药性 植物抗逆 寻找差异蛋白质 万古霉素处理前 万古霉素处理后 细胞 正常组织 肿瘤组织 组织 蛋白质双向电泳技术 双向电泳流程示意图 样品的破碎 原则——最大限度提取蛋白 样品的来源 温和  易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 方法 真菌 剧烈 温和破碎法 • 渗透压冲击(无壁细胞) – 低渗液 • 反复冻融法(细菌) – 液氮冷冻 • 去污剂降解(酵母、霉菌) – 降解缓冲液(含尿素和去污剂) – SDS(应在IEF前去除) • 酶降解(植物、细菌、真菌) – 溶菌酶(细菌) – 纤维素酶，果胶酶(植物) – 溶壁酶(酵母) 剧烈破碎法 • 超声破碎(细胞悬浮液) – 需以冰冷却避免过热 • 弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物 – 细胞在剪切力作用下破碎 • 研磨(固体组织，微生物) – 液氮中将固体组织磨成细粉末 • 样品研磨器(用于少量样品的处理) – 用于精确样品 • 珠磨法(胞悬液，微生物) – 通过磨珠研磨破坏细胞壁 样品的沉淀 • 作用 – 去除杂质 – 浓缩样品 对于疏水性特别强的蛋白 – 抑制蛋白酶活性 如膜蛋白 – 硫脲 • 关键-可溶性 – SDS – 获得可以重新溶解的蛋白 – 新型两性表面活性剂(如磺 基甜菜碱) • 常用方法 – 硫酸铵沉淀 – TCA沉淀 – 丙酮沉淀 – TCA/丙酮沉淀 – 醋酸铵/ 甲醇/苯酚抽提 样品中杂质的去除 • 去除原则 – 尽量不丢失蛋白