四步法消除SYBR Green Ⅰ实时定量RT2PCR中.pdfVIP

ISSN 中国生物化学与分子生物学报 2004 年 6 月 CN 　113870Q Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 20 (3) :387～392 ·技术与方法· 四步法消除 SYBR Green Ⅰ实时定量RTPCR 中 引物二聚体的影响 张驰宇1 ,2) , 　张高红1 ,2) , 　杨 　敏1) , 　贲昆龙1) ( 1) 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室, 昆明　650223 ;2) 中国科学院研究生院,北京　100039) ( ) 摘要 　为建立一种新的 SYBR green Ⅰ实时定量RTPCR 方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 PDs 对实时定量结果的影响. 对 RTPCR 特异性扩增产物和 PDs 分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线 ( ) 分析. 依据 PDs 和扩增产物的熔解温度 T 特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂 m ( ) 的 5 s 恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于 PDs 的 T ,但低于扩增产物的 T ,简称该法 m m 为四步法. PDs 的 T 通常高于 72 ℃,但低于扩增产物的 T . 将四步法第四步的温度设置在高于 m m PDs 的 T ,但低于扩增产物的 T 时 , 四步法能够有效地消除 PDs 的影响. 对三步法和四步法 SYBR m m green Ⅰ实时定量RTPCR 进行了比较 ,发现三步法根本不能用于 RNA 的实时定量 ,而四步法能够实 现包括低丰度 RNA 在内的 RNA 的定量. 选择 T 值尽可能小的引物 ,使 PDs 与扩增产物 T 值之间 m m 有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 ,并可成功地用于低丰度 RNA 的准确定量. 关键词 　引物二聚体 ,荧光实时定量 RTPCR ,SYBR green Ⅰ, 四步法 ,RNA 定量 中图分类号 　Q291 ,Q786 Elimination