营养︰实验四尿液还原性维生素C和肌酐测定.docVIP

年级 组 姓名： 学号： 实验带教老师： 尿液还原性维生素C和肌酐测定 【实验目的】 掌握还原性维生素C和肌酐测定的原理和基本方法。 了解尿液还原性维生素C和肌酐比值测定在评价人体维生素C营养状况过程中的意义。 【实验材料】 实验仪器：微量滴定管，锥形烧瓶，移液管，100ml容量瓶，10mm比色杯，分光光度计。 实验试剂：1%草酸，碱性苦味酸，0.0010mol/L碘酸钾标准应用液，1%淀粉溶液，6%碘化钾溶液，0.02mg/ml维生素C溶液，2,6-二氯酚靛酚，0.1mg/ml肌酐。 【实验原理】 2,6-二氯酚靛酚法测定尿中还原性维生素C 还原性维生素C与2,6-二氯酚靛酚染料（红色）在酸性条件下生成脱氢型维生素C和无色染料，利用这种颜色变化可对其进行标定。 尿肌酐测定 肌酐与碱性苦味酸作用，生成橘红色苦味酸肌酐，可根据颜色进行比色测定。 【实验步骤】 2,6-二氯酚靛酚法测定尿中还原性维生素C 1. 维生素C溶液的标定：将维生素C溶液5ml、6% KI 0.5ml加入锥形瓶，再加入淀粉溶液3滴，然后用0.0010mol/L碘酸钾标准液标定，终点为淡蓝色。（做三次取平均值）按以下计算式计算维生素C标准液浓度：维生素C标准液浓度（mg/ml）= VKIO3×0.088/V维生素C。 2. 2,6-二氯酚靛酚染料的标定：维生素C标准液5ml与1%草酸5ml加入到锥形瓶，然后用待定浓度的染料滴定至淡红色，15秒不褪色为止。按以下计算式计算染料浓度：T染料=C维生素C×V维生素C/V染料。 3. 尿样滴定：尿样5ml与1%草酸5ml加入到锥形瓶，用2,6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，15秒不褪色为止，记录染料用量。 二． 尿肌酐测定 1. 制备尿样稀释液：取尿样5ml于100ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。 2. 制定标准曲线及尿样测定，见下表1 表1 肌酐标准曲线标准管和样品管的配制（ml） 管号 0 1 2 3 4 5 尿样 0.1mg/ml肌酐 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 尿稀释液 — — — — — — 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 — 苦味酸试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 3. 依次加入以上试剂混匀，在水浴箱内加热20min，再用分光光度计比色测定，比色波长510nm，0号管调零，绘制标准曲线。 【实验原始结果记录】 维生素C溶液的标定：V（KIO3）=1.90ml 2,6-二氯酚靛酚染料的标定：V染料=1.150ml 尿样滴定：V染料=1.750ml 管号 0 1 2 3 4 5 尿样 吸光度 0.000 0.200 0.417 0.606 0.800 0.977 0.273 【实验结果】 1.维生素C标准液浓度（mg/ml）= VKIO3×0.088/V维生素C =1.90×0.088/5=0.033mg/ml T染料=C维生素C×V维生素C/V染料=0.033×5/1.150=0.145mg/ml 尿中还原性维生素C含量（mg/ml)=T染料×V染料/V尿样 =0.1454×1.750/5=0.0509mg/ml 在EXCEL上出标准曲线回归方程为y=0.9685x+0.0189 R2=0.9988 尿样的吸光度y=0.273带回方程得出X=0.262，尿样管中肌酐毫克数为0.0262mg 尿中肌酐含量（g/ml)=尿样管相当于标准管之毫克数/（实际用尿量×1000） =0.0262/(1.0×5/100×1000） =0.005（g/ml) 5.尿中还原性维生素C（mg）/肌酐（g）=10.2mg/g 【实验讨论】 正常水平：尿样取自班级一男同学，男性＞9mg/g，为正常。 2.2，6－二氯酚靛酚溶液滴定法是测定维生素C的经典方法，简便，快速，准确地测量出维生素C的含量，但同样其存在很多缺点：生物组织中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸同样有维生素C的生理作用，用此法测不出来；生物材料提取液中含有其他还原性物质，也可使2，6－二氯酚靛酚溶液还原脱色而而引起差； 实验应迅速滴定，防止维生素C被氧化。