实验一质粒DNA的提取纯化和琼脂糖凝胶电泳.docVIP

实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA凝胶成像系统紫外投射仪 利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。 DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光。但需注意EB是一种强诱变剂！ 三、实验材料、仪器与试剂 （一）、实验材料 含有质粒pBS的DH5a菌株 （二）、实验仪器 微量移液器， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统紫外投射仪 （三）、实验试剂与配制 小量质粒DNA提取试剂盒 LB液体培养基: 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 用NaOH调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌20分钟。 LB固体培养基：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。 氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 ℃下保存备用。 TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 ℃冰箱。 琼脂糖 5′TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml 的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml. 6′上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。 溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。 DNA电泳分子量标准（DNA marker）Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker或其它MARker。 四、操作步骤 （一）、质粒DNA的提取纯化 第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均匀，4℃保存。 细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5a菌株接种在LB固体培养基（含50mg/ml Amp）中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50mg/ml Amp）中，37℃培养约12小时至对数生长后期。 取1.5ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清； 用0.25ml已加入RNaseAl的S1溶液悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块； 加0.25ml S2溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min； 加入0.5ml 4℃预冷的S3溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置2min。最高速度(12000rpm)离心5 min； 吸取步骤5中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心l min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1 min，弃滤液； 将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液，3600rpm离心 30s，弃滤液； 将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液，3600rpm离心30s；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤液； 将制备管移入离心管中，12000rpm离心1 min； 将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在DNA制备膜正中央加60μl水或洗脱液，室温静置lmin。 12000rpm离心l min洗脱DNA。 （二）、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 稀释缓冲液的制备：用蒸馏水将5′TBE缓冲液配制成0.5′TBE稀释缓冲液. 1％琼脂糖凝胶′TBE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。 胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。在冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5mg/ml, 即10mg/ml的母液加2.5ul，混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加0.5′TBE稀释缓冲液至液