大工生化实验报告.doc

大工生化实验报告 小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量 摘要本实验从新鲜且冷冻保存的小牛肠出发,通过刮取、离心分离、析出、提纯等方式提取小牛肠中碱性磷酸酶，利用紫外分光光度法测定该酶的活性，并利用考马斯亮蓝法测定所提取的蛋白质含量，最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对比marker谱带近似得出蛋白样品中蛋白质的相对分子量。 关键词碱性磷酸酶；分离纯化；酶活；紫外分光光度法；考马斯亮蓝；蛋白质；聚丙烯酰胺凝胶；蛋白质分子量。 前言 碱性磷酸酶能催化核酸分子脱掉5’-磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。主要应用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。 本实验以小牛肠为原料，分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。小牛肠碱性磷酸酶的分子量为145000，等电点为5.7.碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水解释放出对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率，可测定酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。 应用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，是一种常用的蛋白质快速微量测定法。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm，后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.01～1.0mg/ml）,蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白酶分子质量，根据标准样品在电泳中所做出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。1 实验部分 1.1 试剂与仪器 1.1.1试剂 （1）正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）； （2）1 mol/L 醋酸（HAc），1 mol/L NaOH，硫酸铵； （3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HCl，pH=8.0； （4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液,pH=9.8； （5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液（已 加入到底物缓冲液中）； （6）30% 丙烯酰胺（acrylamide，Acr）置棕色瓶； （7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH=8.8，已加入10% SDS； （8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH=6.8，已加入10% SDS； -3 （9）10% 过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所 必需的自由基，需新鲜配制）； （10）TEMED（四甲基乙二胺）（小离心管装T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合）； （11）上样缓冲液（小离心管装S）：称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加 0.1 mL巯基乙醇、2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水 定容至10 mL； （12）染色液：配置含0.1% 考马斯亮蓝R250，40%（体积分数）甲醇和10%（体 积分数）冰醋酸的染色液500 mL，过滤后备用； （13）脱色液：500 mL 10%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的脱色液1000 mL； （14）电泳缓冲液（含0.1%SDS，0.05mol/L Tris,0.384mol/L 甘氨酸pH=8.3）。 1.1.2仪器 匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿（光程0.5cm和1.0cm各两个）、电泳仪、电泳槽、制胶板、揺床。 1.2实验过程 1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提取 1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。 2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加1.5倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复 20次。 3）缓慢加入（总体积）一倍体积冰冷正丁醇高速匀浆15s，重复20次。取60mL 匀浆液放入离心管中，另一离心管用水配平，在4℃、10000 rpm条件下离心15min。 4）用滤布过滤去除杂质（滤饼），倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用 1mol/L HAc溶液调pH到4.9。4℃