第04章蛋白质的分离纯化及表征.pptVIP

蛋白质的分离、纯化、表征 大小 (一)根据化学组成测定最低相对分子质量 公式: 最低相对分子质量= 铁的原子量 ×100 铁的百分含量 （二）渗透压法测定相对分子质量 公式: R:气体常数 T:绝对温度 C:溶质浓度(g/m3) 实际是测定几个不同浓度的渗透压。 (三) 蛋白质的扩散和扩散系数 扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。 菲克定律一： dm=-DA dc dt dx D：扩散系数。当浓度梯度为一个单位时，在一秒内通过1厘米2面积所扩散的溶质量。 菲克定律二： 测定扩散系数 (四) 沉降分析法测定相对分子质量 沉降速度法 Mr= R Ts D(1-Ｖρ) Ｖ :蛋白质的偏微比容 S：沉降系数S值 ρ：溶剂密度 D：扩散系数 沉降平衡法 Mr= 2R Tdln(c2/c1) (1-Ｖρ)Ｗ2(x22-x21) W:转头的角速度 c2，c1：离转中心x1，x2处的蛋白质浓度 (五) 凝胶过滤法测定相对分子质量 （六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 蛋白质分子质量 每两个氨基酸残基结合一SDS分子 后果： 1 掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别。 2 改变了蛋白质单体分子的构象。 公式： 形状 X射线晶体结构分析 前处理 组分级处理 细分级处理 根据分子大小不同 透析、超过滤、梯度离心、凝胶过滤 根据溶解度差别 等电点沉淀、PH控制、蛋白质盐溶和盐析、有机溶剂、温度 根据电荷不同 电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析 选择性吸附的纯化方法 羟磷灰石层析、疏水作用层析 对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 高效液相层析和快速蛋白质液相层析 六 蛋白质含量测定与纯度鉴定 含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法等 纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、溶解度等 * * 第 四 章 一 蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 *蛋白质的两性电离 二 蛋白质分子的大小与形状 三 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (一)胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 水化膜 + + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 带负电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 酸 碱 酸 碱 脱水作用 脱水作用 脱水作用 溶液中蛋白质的聚沉 （二）蛋白质的沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 沉淀方法 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 *有机溶剂深沉法 如乙醇,丙酮等沉淀。 *重金属盐沉淀法析 金属离子 *生物碱试剂和某些酸类沉淀法析 生物碱 *加热变性沉淀法析 加热 四 蛋白质分离纯化的一般原则 五 蛋白质分离纯化的方法 1 几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 2 层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分