23-重组DNA技术要点.ppt

基因工程面临的问题： （1）转基因生物的环境风险 （2）转基因生物的安全和伦理问题 * * * . * * λ噬菌体 ◆ λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代, 而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力 ◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建 柯斯质粒(cosmid) 柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的 具有λ噬菌体的cos序列(12bp) 和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。 可接受长达50kb的外源DNA片段 穿梭载体是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体 不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列以及选择标记性状，具有多克隆位点 穿梭载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC） 根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor- inducing, Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒 Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA(transfer DNA,T-DNA) 当T-DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine), 作为土壤农杆菌的碳源和氮源 Ti质粒 基因工程的基本步骤 基因的获得 阳性克隆的分析与鉴定 目的基因与载体连接(DNA分子重组) 目的基因导入受体 产品表达和纯化 基因的获得 (一) 从基因库中分离基因 ◆大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库 ◆如菌斑杂交法(plaque hybridization)筛选λ噬菌体核基因库 (二) 聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 (三) 人工合成基因 (四) RT-PCR 阳性克隆的分析与鉴定 限制性酶图谱 阳性克隆的分析与鉴定 核酸序列分析 目的基因与载体连接(DNA分子重组) DNA分子重组 目的基因导入受体 植物基因工程过程 小结 在基础研究中的应用 在农业和工业上的应用 在医学中的应用： 基因工程用于生产蛋白质类药物 基因工程用于疫苗生产 基因工程用于基因治疗 遗传疾病诊断 RFLP 法 基因工程的应用 在农业和工业上的应用 1.增加农作物产品的营养价值，如增加种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋白的必需氨基酸比例等 2.提高农作物抗逆性能如：抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能 3.提高光合作用效率将是提高农作物产量的一个有效方法 4.生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂 在农业和工业上的应用 5. 增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25% ，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等 6. 运用转基因动物的技术，可培育畜牧业新品种 7.“吃油”工程菌 8. 纤维素酶 ???????????????????????????????? 不易腐烂的番茄 ???????????????????????????????????? 动物植物的遗传改良 抗虫植物 化学农药 兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽 抗虫棉花 Swiss researchers have produced rice capable of synthesizing beta-carotene, the precursor of Vitamin A (Ye et al., 2000). This rice variety is now being crossed into adapted varieties, with field tests possible in a year or two. Grape vines are susceptible to several diseases that reduce the amount and the quality of wine grapes and table grapes or even kill the