酶工程实.docVIP

实验一 植物体内过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。 二、原理 在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制： 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。 反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。 四、实验步骤 1. 酶液提取 称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定 吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。 五、酶活性计算 按下式计算酶的相对活性 △A470 × 酶提取液总量（ml） 酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时酶液用量（ml） 实验二 尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾—碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使用前稀释10倍) 4,移液管 5,试管 6,恒温水浴锅 操作】 1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升. 2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合 (若尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,然后任其流出.反复三次,使全管混匀. 从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管……依次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,1/4,1/8……1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作为对照管. 3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37℃,并记录时间.注意保持水浴的温度. 4,保温30分钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到紫色表明有淀粉的水解中间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在. 计算】 选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫升.即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活力单位.  SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。(二)材料、仪器设备及试剂 1. 材料：新鲜苎麻叶片 2. 仪器设备： (1) 研钵(预冷)； (2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机r/min, 湖南星科科学仪器有限公司)； (3) PUS-2018型 半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司)； (4) 移液管（10ml,5ml,0.5ml,0.2ml