细胞实验操作基本流程.docx

细胞实验操作基本流程（基于明确的细胞试验计划）1. 实验物品准备1.1 实验耗材准备书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。操作准备：物品清洗、干燥、打包灭菌、合理放置。1.2 实验试剂准备书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。操作准备：选择合适的物品存放地点；使用前集中放置；需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好；需要无菌配制的试剂在无菌操作要求下配制。2. 实验预约2.1 操作预约：401室在预约本上登记；分析测试中心向屈老师交申请单后在预约本上登记。2.2 细胞冻存复苏预约：每周定时开放液氮罐，由负责同学在群里通知。2.3 细胞检测预约：填写申请单，向主管老师申请。3. 细胞房环境检查3.1 清洁消毒：操作前后有无清洁台面、地面，并行紫外线杀菌10-15分钟。3.2 仪器设备：运行是否正常，有无灯光闪烁报警或标志警示，有无异常状况。3.3 台面：是否洁净无污垢，有无多余物品放置，必要物品是否放置齐备。4. 清洁准备4.1 洗手：肥皂洗——5‰新洁尔灭泡手10秒——70%酒精喷手4.2台面物品放置：正中：酒精灯；左侧：吸管及其他耗材盒子；右侧：试管架、大镊子、酒精棉球瓶、打火机、移液器；左上方：试剂瓶；右上方：废液缸5. 实验操作5.1 基本操作：换液、传代、冻存、接板、复苏、细胞计数、细胞观察5.2 垃圾处理：培养基、缓冲液等使用过的无害废液用废液缸装；固体垃圾丢入垃圾筐中6. 实验善后6.1 可回收实验耗材处理：吸管、试管、离心管等可反复使用的耗材按标准流程清洗。6.2 不可回收实验废物处理6.2.1 酸碱类废液分类倒入废液瓶存放，由学院通知处理6.2.2 无害废液弃入水槽，大量流水冲洗6.2.3 固体垃圾放入垃圾袋，丢入垃圾桶6.3 种子细胞处理：实验过程中需要保种或实验完成后仍有未用完的种子细胞，按标准流程进行细胞冻存，以待后续使用。6.4 实验试剂处理：未用完的试剂重新放回合适的存放地点；如试剂污染或变质，按实验废物处理。6.5 报备：耗材、试剂如需补充，需要向老师申请批准购买；仪器设备如有损坏，需要告知负责同学或老师进行维修。7. 清洁值周和安全检查7.1 清洁值周：轮流进行，以导师分组，每日例行清洁和周二、周五大扫除，需要按要求进行清洁并在值周表上登记及拍照。7.2 安全检查：清洁值周的同时需要每天巡视细胞房、准备间内的电器设备，有情况需要及时上报。注意事项：1、试验计划三原则：要做什么、为什么这么做、准备怎么做2、实验操作三原则：多看、多问、多想3、突发事件处理：及时向负责同学、老师汇报情况细胞操作相关仪器设备使用恒温干燥箱使用注意事项注意事项(一)干燥箱恒温干燥时恒温室下方的散热板上，不能放置物品，以免烤坏物品或引起燃烧。(二)放入箱内的物品不应过多、过挤。(三)严禁把易燃、易爆、易挥发的物品放入箱内，以免发生事故。(四)如果发现干燥箱箱门下方红灯报警必须尽快切断电源。(五)放置物品干燥时间不超过24小时。二氧化碳培养箱使用箱门应轻开轻闭，避免粗暴开关。取出细胞时应避免箱门长时间敞开，以免培养箱内环境不稳定，孵箱中的水盆应定期（每2周左右）更换无菌双蒸水，并擦洗水盆，紫外照射30分钟。二氧化碳气瓶更换先关闭总阀和分压阀，更换后先开总阀，再慢慢调整分压阀，指针总阀在5分钟左右，分压阀指针在0.15左右。超净台使用使用超净台工作15分钟前开紫外灯进行照射灭菌，在进入操作之前应关掉紫外灯，10分钟左右后进入。超净台上力求简洁，以利于保持无菌状态，每一步操作均应用酒精擦拭，不宜对着超净台说话。倒置相差显微镜使用分为3点：相差装置的调换与安装。卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可以吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。调焦。打开光源，旋转激光器装盘将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进进光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。合铀调整。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出看远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重