蛋白质分子基础蛋白质一级结构测定.pptVIP

蛋白质化学 蛋白质一级结构的测定 序列测定的基本方法学 将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。再将不同方法得到的序列进行比对，就可以得到肽链的一级结构。 序列测定一般步骤 纯度要求:纯度在97%以上。 双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。 分子量测定 多肽链的组成，二硫键的断裂。 蛋白质的氨基酸的组成。 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析 进行正常的序列测定**** 蛋白质和肽的氨基酸组成 蛋白质的水解 酸水解 6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸,105-110℃水解20小时。 优点:不容易引起水解产物的消旋化。 缺点:Trp被沸酸完全破坏； 有-OH的Ser或Thr小部分被分解； Asn和Gln侧链的酰胺基→-COOH。 注:加入0.1-1%巯基乙醇和0.05-0.1%苯酚, Tyr或Thr收率提高 碱水解 5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 缺点: 水解过程中许多AA都受到不同程度的破坏，产率不高。 水解产物发生消旋化。 优点:Trp在水解中不受破坏。 磺酸水解 4mol/L甲基氨酸(含0.2%β-吲哚乙胺)色氨酸可回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。 磺酸水解 4mol/L甲基氨酸(含0.2%β-吲哚乙胺)色氨酸可回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。 蛋白质的水解 酶的水解 选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。 优点： 其他水解不稳定的氨基酸，如Trp、Asn、Gln等，都可以用此方法。 缺点： 不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。 氨基酸的分离与含量测定 特殊氨基酸的测定 色氨酸的测定 紫外吸收法 Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比例，可用方程计算出Trp的含量： 对－二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下可与醛反应，产物在590nm下有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用此法测量Trp含量。 巯基含量测定 DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸) 反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收，根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含量。 末端氨基酸的测定 N-末端的测定 Sanger反应——2、4—二硝基氟苯（DNFB）反应 Edman反应-PITC与多肽的反应 Edman反应 苯异硫氰酸酯（PITC）法：　　　　　　　　多肽 or 蛋白质末端NH2＋PITC　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　PTC－多肽 or 蛋白质　　　　　　　　　　　　　↓有机溶剂　　　┌－－－－－－N末端的PTC－AA发生环化　　　∣　　　　　　生成苯乙内酰硫脲的衍生物　　　∣　　　　　　　　　　↓　　　∣　　　　　　　　脱离肽链　　　∣　　　除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。　　　↓　（因为，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低）　　干　燥　 /　∣　\薄层 气相 HPLC层析 色谱　　 丹磺酰氯（DNS）法 封闭的N末端的测定 封闭的N端测序 末端为Gln的蛋白质发生环化反应，生成焦谷氨酸酰基衍生物，此衍生物可用焦谷氨酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端，释放出少一个Gln的肽。 释放的肽可用Edman等方法等正常方法测定。 N端甲酰基可通过温和酸水解除去，活用甲酰基酶除掉。 C末端分析 a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法（最有效、常用） 肼解法  还原法 肽链C末端AA　　↓硼氢化锂α－氨基醇　↓水解 C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓ 色谱法鉴定 羧肽酶法 羧肽酶法：最有效，最常用的测C端殘基方法性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降解，释放出游离AA。　　 常用4种羧肽酶：A－－　胰脏　　　 能释放除Pro,Arg,Lys之外所有C末端殘基B－－　胰脏　　　 只能水解以碱性AA,Arg,Lys为C末端的肽键C――　柑桔中