总RNA变性琼脂糖凝胶检测.docVIP

实验19　总RNA的变性琼脂糖凝胶检测 【实验目的】 掌握总RNA变性胶电泳的原理和方法。 【实验原理】 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。需快速检测总RNA，普通的1% (m/V)琼脂糖凝胶。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到8s rRNA、8s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。【器材与材料】 1．器材 水平式琼脂糖凝胶电泳系统、电子天平、移液器、Tip头、电炉、紫外透射检测仪 2. 试剂 (1) 0.1% (V/V) DEPC水 200ml 双蒸去离子水加0.2ml DEPC焦炭酸二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 (2) 10电泳缓冲液 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） 0.4mol/（pH 7.0） NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3) 50mL变性琼脂糖凝胶1% (m/V) 10电泳缓冲液 5 ml 琼脂糖 0.5 g 0.1% (V/V) DEPC水 36.5 ml 加热溶解，稍冷却，加入8.5 ml 37%(V/V)甲醛。? (4) 上样缓冲液：50% (V/V) 甘油，1mmol/L EDTA，0.4% (m/V) 溴酚，0.4% (m/V)二甲苯蓝。 (5) 甲酰胺（去离子）。材料 植物或动物的总RNA溶液。【操作步骤】 1．电泳槽制胶用具清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗3% H2O2灌满电泳槽室温放置10min0.1% (V/V) DEPC水冲洗，晾干备用。 制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：2μl 10电泳缓冲液、3.5ml甲醛、10ml甲酰胺、3.5μl RNA样品。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。 电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 电泳结束后通过紫外透视仪观察。 【】 本实验中必须RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。 【思考题】 如何判断RNA提取物的质量？