猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

• 18 • 生物技术 中国畜牧兽医 2014 年第 41 卷第 6 期 猪瘟病毒 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用 岳锋1 ， 2 ，朱艳平1 ， 2 ，银梅3 ，王选年1 ， 2 (1.新乡学院生命科学与技术系，河南新乡 453003; 2. 新乡学院生物技术研究所，河南新乡 453003; 3. 河南科技学院动物科学学院，河南新乡 453003) 摘要:根据 GenBank 中猪瘟病毒Cclassical swine fever virus ， CSFV)5NTR 的保守序列，设计 1 对特异性引物和 TaqMan 探针，以 CSFV 全长基因重组质粒 pGEM~CSFV 为标准品，建立 TaqMan 实时荧光定量 PCR 标准曲线，进行特异性、敏感性和 重复性试验，并检测人工感染 CSFV 后不同时期猪血浆中 CSFV 的载量。结果表明，标准曲线循环阂值与模板浓度具有良好 2 的线性关系，R =0.999; 敏感性高，最低检测限为 1 X 101 /μI斗特异性强，与猪圆环病毒 2 拷贝 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病 毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好，组内和组间变异系数均小于 2% 。人工感染 CSFV 后第 7 天猪血浆 中 CSFV 载量达到峰值，之后逐渐降低。结果表明，建立的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 方法具有特异、敏感、重复性好等优 点，为 CSFV 的定量分析及临床诊断奠定基础。 关键词:猪瘟病毒;实时荧光定量 PCR;TaqMan 探针 中图分类号:S858.28 文献标识码:A 文章编号: 1671-7236C2014) 06~00 18~05 猪瘟(classical swine fever ,CSF) 是由猪瘟病毒 2004; 李菲等，2010) 。实时荧光定量 PCRCfl uores Cclassical swine f ever virus , CSFV) 引起猪的一种 cent quantitative PCR , QPCR) 是在 PCR 技术基础 热性、出血性传染病，是严重威胁养猪业的重要传染 上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，该技 病之一，被世界动物卫生组织C office international 术将 PCR 与荧光检测结合起来，不仅具有了传统 des epizooties ,OIE) 列入 OIE 疫病名目，也是中国 PCR 技术快速、特异等特点及光谱技术的高敏感性 和高精确定量的优点，同时还可直接检测 PCR 过程 农业部规定的一类传染病(殷震等，1997) 。世界各 中荧光信号的变化过程，从而使其具有特异性强、灵 地均有发生，其中以亚洲和欧洲最严重，近年来中国 敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等 CSF 的发病以非典型性的临床症状和病理解剖学 优点(史子学，2006); 不仅克服了传统 PCR 的假阳 变化为主，发病率和死亡率明显降低，给其临床诊断 性和不能准确定量等弊端，还可对样本中的核酸进 带来一定困难CEdwards 等， 2000; 宁宜宝等，2011 )。