猪胃蛋白酶原A基因密码子优化和在毕赤.docxVIP

猪胃蛋白酶原 A 基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究摘要天冬氨酸蛋白酶一般被称为酸性蛋白酶，在酸性条件下可催化水解蛋白质，是目前重要的工业用酶之一。胃蛋白酶属于天冬氨酸家族，是研究蛋白质结构与功能关系的重要模型。胃蛋白酶广泛存在于脊椎动物胃液中。胃蛋白酶经济价值高，用途广泛，胃蛋白酶在制革、方便食品、奶、口香糖加工制造等行业也有一定的用处。目前，商业、医药途径获得的胃蛋白酶主要从动物胃组织中提取，受动物脏器资源的限制，胃蛋白酶价格较高;容易残留一些动物自身的蛋白酶类，如一些组织蛋白酶等。而微生物反应器具有效率高效，操作简单，能够降低成本等优点，所以，通过筛选微生物反应器，然后规模化生产胃蛋白酶颇有发展前途.本文利用基因工程开展胃蛋白酶的表达研究，为解决这些问题提供了新的研究方向。第一，根据Genebank上公布的猪胃蛋白酶原 A 基因序列，进行引物设计，通过RT-PCR克隆获得了湖北白猪胃蛋白酶原 A 基因cDNA全长，包括一个1158bp的读码框，编码385个氨基酸，其中N区包含15个氨基酸组成的信号肽，成熟的胃蛋白酶原A由370个氨基酸残基组成。与J04601比较，结果表明核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%和98.7%。序列已提交Genebank，登录号为EF108301。第二，在猪胃蛋白酶原 A 克隆和序列分析的基础上，构建了毕赤酵母胞内表达载体 pPIC3.5K-pA,电转化 GS115,通过纤维蛋白-醋酸洋红消化试验和干酪素琼脂平板法筛选出两株高表达菌株。还研究了不同 pH、不同诱导时间、不同启始浓度和甲醇诱导浓度等因素对表达量的影响。结果表明：在 pH7、诱导 72h、启始诱导浓度为 OD600 为 2、甲醇诱导浓度为 1%时，重组胃蛋白酶原表达量为56mg/L,比优化前提高了 1.7 倍。WB 检测显示，重组蛋白具有正常的生物活性。第三，根据毕赤酵母密码子的偏嗜性，利用定点突变，成功地对分布在基因的 C 区和 N 区两端的可能影响表达量的稀有密码子进行了优化, 希望能够进一步提高重组酵母表达量。关键词: 胃蛋白酶原 A；毕赤酵母；克隆；表达；优化AbstractAspartic acid proteases, known as acidic proteases, can catalyze the hydrolysis of proteinunder the acid condition.Pepsin iswildly presentedingastricjuiceofvertebrate.Currently，commerciallyusedpepsin is generally obtained from animal stomach tissue，which is veryexpensive andun-pure because of the animalorgansresource constraintsandother proteases .Therefore，a great interest has been focused on the new method of producing pepA (Pepsinogen A). Among these，the microbial production is supposedtobethemost promisingmethodbecauseofitshigh yield, simple production process and lower cost.Therefore，the objective of thisstudy is tryingto produceefficientlyrecombinant porcine pepsinwithgenetic engineeringtechnologyinmicrobialsystem.Aspartic acidproteases are widely applied in the fields of feed additive, vintage, food, leather and medicine.Porcine pepsin A, which is the important model for the study of structure-functionrelationship of protein, belongs to the family of aspartic protease. Using gene engineering to study the expressionof pepsin will supply a new way for solving these questio