病理科免疫组化的技术员讲训.docVIP

病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 一、病理科免疫组织化学技术免疫组织化学染色前的准备事项 (一)组织切的制备 (二)抗体的选择、稀释和保存 1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效 降低)。抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。抗体的稀释。 (1)一般用0.01M BS(生理盐水磷酸盐缓冲液，pH值72。 (2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。 (3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。 (三)被检测组织内抗原的修复 经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复抗原修复缓冲液。 (l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1柠檬酸溶于10ml蒸馏水中，用M NaOH调节pH值至6.0)。 (2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，高H值(50mM Tris.，mM EDTA，pH.0)，或商品化的该高，mM EDTA，pH.0)，或商品化的该高pH修复液等。抗原修复的常用方法。 (l)胰蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化。 ②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。 ③37℃下温育2040min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。 ④蒸馏水冲洗，终止反应。 ⑤阻断内源性过氧化物酶。 ⑥进行免疫组织化学染色。配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1胰蛋白酶溶于.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。 （2)胃蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化 ②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。 ③37下温育1030min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短) ④浸人蒸馏水，终止反应。 ⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以 0.M HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。) 3)微波修复抗原法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 ②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 ml，盖上具有小孔的盖子。 ③将该容器置于微波炉(705800W)中央加热(95)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。 ④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却1520min。 ⑤蒸馏水冲洗。 ⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 ⑦用TBS或 PBS液冲洗。 ⑧进行免疫组织化学染色。 4)热水浴法 ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 ②向装组织切片的容器加人足量(例如20抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至9599℃(不沸腾)预热。 ③将组织切片插人已预热的容器内，温育2040min。 ④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。 ⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。 ⑥蒸馏水冲洗。 ⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 ⑧用TBS或PBS液冲洗。 ⑨进行免疫组织化学染色。 5)压力锅法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 ②向45.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)， 不加阀情况下加热至沸腾。 ③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。 ④加阀情况下，将组织切片加压min。 ⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。 ⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。 ⑦蒸馏水冲洗。 ⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 ⑨用TB或PBS液冲洗。 ⑩进行免疫组织化学染色。 组织切片中内源性酶的阻断 1.内源性过氧化物酶