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胶体金标记实验步骤 点击次数： 13? 发表于：2008-08-19 14:02　转载请注明来自丁香园 来源： HYPERLINK 丁香园 ? 1、蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备? 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 （1）待标记蛋白溶液的制备?将待标记蛋白预先对0.005Mol/L?pH7.0?NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100?000g4℃离心1h，去除聚合物。 （2）待标胶体金溶液的准备?以0.1Mol/L?K2CO3或0.1Mol/L?HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时，调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10. 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。? 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 2、蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定 （1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml. （2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L?pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml～50μg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 （3）5min后，在上述各管中加入0.1ml?10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 （4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。 将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到?1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，５分钟后加入0.1ml?10％NaCl溶液，混匀后静置２小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。 3、标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合? 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L?K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10. 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 下述标记步骤最为常见：? ①用0、1mol/L?K2CO3或0.1mol/L?HCl调节金溶胶至所需pH(标记ＳＰＡ时调到pH6.0)。 ②于100ml?金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为２～３ml），搅拌２～３分钟。 ③加入5ml１％PEG20000溶液。 ④于10000～100000g离心30～60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。 ⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml?PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以?Ａ1cm/540nm=1.5左右为宜，以?0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。 ⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex?G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含?0.1％ＢＳＡ的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以Ａ蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0. 以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。 4、胶体金标记蛋白的纯化 （1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1?200r/min，5nm金胶粒用1?800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6?000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14?000g，4℃离心1h.仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0