第三章转基因生物第十三周星期五上午.ppt

一般说来，从细菌到哺乳动物的全部生命有机体，它们的基因都是由DNA构成的。由于所有生物的DNA的基本结构是一致的，因此，来自两种生命形态的基因可以融为一体。 由此可见，基因的DNA共性，是进行基因工程的重要理论基础之一。 DNA分子是遗传物质和基因的载体。基因是细胞中所有的RNA及蛋白质分子的“蓝图”。 一旦基因发生突变，那么由它指导合成的蛋白质也将随之发生变化，甚至可能导致活性的丧失。 （二）重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源 基因的表达、能接受外源DNA、稳定、对宿主细胞无 威胁。 （三）重组载体的体外验证（in vitro） 重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。 对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体 需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特 性。 （四）基因转移 1）化学法 2）物理法 3）生物法 （五）转基因动物模型的验证 从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行 验证。用核酸杂交、聚合酶链反应、免疫印迹杂交、 酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方 法，筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后检测 外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表 达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转 基因动物的生理功能和是否出现某些疾病症状的表型 等。 1）显微注射法microinjection 它是创造转基因动物的有效途径。 优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观； 无需载体 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求　 效率低（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 转基因沉默 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ▲ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。 ▲ 优点： 1.外源基因整合情况的可控性高,可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性　 2.外源基因导入ES细胞的方法多样，如逆转录病毒感染法、电击法等，细胞鉴定及筛选方便 缺点： 1. ES细胞系建立及培养困难 2. 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 4、体细胞核移植方法 ： 将外源基因导入到体细胞中，筛选、培养、扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植，即把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活，将重构胚胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。 缺点： 技术上难度大，成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。 直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子与 外源ＤＮＡ共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后 使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精， 并使外源DNA整合到染色体中。 目前国际上只有1例成功模型，国内也很少有相 关报道，精子载体法很少被应用。 　 转基因动物研究出现的问题 1、制作转基因动物效率低：如显微注射法生产转基因动物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊，转基因阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制：转基因随机整合于动物基因组中，有可能引起宿主细胞染色体的插入突变，可造成插入位点的基因片段的丢失及位移，也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。 3、转基因表达水平低：许多转基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，出现异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低 1、转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具。如研究基因的结构与功能的关系、细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。 2、可用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。如代谢病高歇氏(Gaucher)病转基因小鼠的应用。 3、转基因动物技术可由于改造动物的基因组而改良其经济性状，提高经济效益。 4、转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器。如转基因山羊抗凝血酶III、转基因绵羊?1-抗胰蛋白酶、转基因兔的?-葡萄糖苷酶。 5、通过转基因动物可以生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器官和组织。如家畜胎儿神经细胞可替代人类神经细胞用于帕金森症的治疗。 第三军医大学西南医院将转基因乳猪皮用于皮肤移植。猪器官的体积和形状以及DNA基本与人类相似，是理想的肾、心、肝等器官供应者，但存在免疫排斥，