实验一 蛋白质含量测定方法研究.docxVIP

生物化学实验预习报告实验一蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景蛋白质含量的测定广泛应用于生产实践、医药卫生等各个领域，如测定牛奶等食品中蛋白质的含量作为其营养成分的参考值，测定病人尿液中蛋白质的含量以检测其是否患有某种疾病等，因而测定蛋白质的含量具有非常重要的意义。由于蛋白质本身具有一系列的特点（如具有等电点、富含有机氮、含有肽键、存在某些含共轭双键的氨基酸残基、可与某些染料结合等），利用它的这些特点可以通过特定的化学反应或者某些物理手段，将一定量的蛋白质转化为可以方便定量测定的其他量，从而达到测定蛋白质含量的目的。蛋白质诸多特点的存在决定了它会有不同的测定方法，同时由于多种非蛋白组分的存在和干扰以及各种方法本身的局限性（适用条件），每一种测定方法都有各自的优缺点，某一种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，所以多种测定方法的共存是有意义的。目前常用的蛋白质含量测定方法有四种：凯氏定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法，其中后三种方法最常用。在实际工作中，需要根据所测定对象的具体情况综合考虑各种因素(如实验器材的限制、实验所要求的灵敏度和精确度、所测定蛋白质的种类与性质、溶液中存在的干扰物质、测定所花费的时间等)，有选择性地使用某种方法。二、研究目标1.掌握常用的蛋白质含量测定方法的原理和操作流程；（基础目标）2.了解不同测定方法的优点和局限性，掌握在实际工作中不同测定方法的选择条件；（基础目标）3.证明非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在干扰，并通过分析实验结果确定该干扰在实际工作中是否可以忽略。（高级目标）三、研究策略本实验最重要的目的是为了确定非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在的干扰是否可以忽略。思路有两种：一种方法是先测定纯蛋白质溶液中蛋白质含量，随后在该溶液中加入非蛋白组分（如嘌呤、嘧啶等吸光物质，Ca2+等金属离子，无机酸或无机碱，甚至某些色素等），测定此时蛋白质含量，对比两次测定结果，计算相对误差，从而得出非蛋白组分的影响程度；另一种方法是直接使用天然的蛋白质粗提取物（含有非蛋白组分，并将其中包含的所有非蛋白组分看成一个影响因素），来测定粗提取物中的蛋白质含量。考虑到第一种方法中涉及到的非蛋白组分的加入量没有标准，这些非蛋白材料（影响因素）实验室内也不一定有，更重要的是该实验所具有的实际意义不大，故决定采用第二种方案。但是方案二所存在的一个问题是所测组分蛋白质含量的真实值未知，测得的结果没有可以参考比较的依据，所以需要另外找一个可以参考的标准。所采取的策略是先用不同的方法测定已知标准蛋白质溶液的浓度，三个测定值之间会有一定的相关性（或者说测定值之间的变化符合某种趋势），随后测定天然样品蛋白质粗提取液中蛋白含量，得到另外三个测定值，这三个测定值之间同样会存在一定的相关性。如果这两个相关性关系（或者说变化趋势）大致相同，则认为非蛋白组分的影响很小，可以忽略，相反则不能忽略。具体分以下五步走：1.分别用紫外法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法对标准牛血清白蛋白溶液绘制标准曲线；2.结合各标准曲线，用三种方法分别测定待测样液1（待测液1A，500μg/ml BSA、待测液1B，250μg/ml BSA、待测液1C，100μg/ml BSA、待测液1D，10μg/ml BSA）各组中蛋白质的含量；3.用三种方法分别测定待测样液2（生物样品的蛋白质粗提取液，含非蛋白组分）的蛋白质含量；4.对比分析在不同稀释倍数下使用各种方法测定的样液1中各组蛋白质的含量值，与真实值相比较并计算相对误差，得出不同测定方法的精确度或者所适宜测定的蛋白质浓度范围；5.将不同方法测定的样液1及样液2蛋白质含量值分别绘制成曲线图，对比分析两条曲线的波动趋势或相似程度，若波动趋势大致相同，则说明非蛋白组分在蛋白质含量测定中的影响可以忽略；若波动趋势明显相差较大，则非蛋白组分在蛋白质含量测定中的影响不能忽略。四、研究方案及可行性分析1.实验原理与技术（1）凯氏定氮法原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。总体上分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定四个过程。优点：是一种蛋白质的经典测定方法，适用广泛，可用于动植物各种组织、器官及食品等组成复杂的样品测定；测定结果准确，重现性好，往往将该方法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白，该方法也是目前分析有机化合物含氮量最常用的方法。缺点：灵敏度低，0.2~1.0mg/ml；蒸馏与吸收操作装置较复杂，不便于操作；实验过程所需时间较长，操作费时；因实验过程会产生有毒气体，通常需在通风橱中进行样品消化，另外样品与浓H2 SO4 共热，有