木聚糖酶作用机理和区分木聚糖内外切酶测定方法探讨.doc

木聚糖酶作用机理及区分木聚糖内外切酶测定方法探讨 1. 木聚糖酶作用机理 木聚糖是由β－1,4或β－1,3糖苷键连接的一种杂合多聚分子。主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连，侧链上连着多种不同大小的短的取代基,主要有乙酰基、4-甲基-D-葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中其它几种结构性多糖(如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等)以共价或非共价键连接,组成植物细胞重要的结构——细胞壁。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中,处于木质素及其它多聚糖之间,起着连接作用。也正由于这些侧链的不同,使得木聚糖的结构变化范围很大,从仅由β-1,4-糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。因此，要使木聚糖完全降解则需要多种水解酶的协同作用，这其中包括主链水解酶β－D－1,4内切木聚糖酶、β－D－1,4外切木糖苷酶和侧链水解酶a－L－阿拉伯呋喃糖苷酶、a－葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等。 木聚糖降解时，起主要作用的酶是β－D－1,4内切木聚糖酶和β－D－1,4外切木糖苷酶。β－D－1,4内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β- 1，4木糖苷键,其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等；β－D－1,4外切木糖苷酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。另外, 参与彻底降解木聚糖的还有a－L－阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶及能降解木聚糖上阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯键酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键，协同主链水解酶的作用最终将木聚糖转化为它的组成单糖。 ? 2. 区分木聚糖内外切酶测定方法 广义上的木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，因此常规木聚糖酶的检测方法仅是以酶降解木聚糖产生还原糖的量为标准来确定酶活单位，还原糖一般都以木糖等量。而实际上还原糖木糖是各种木聚糖水解酶协同作用的最终产物，这其中主要是内切木聚糖酶、外切木糖苷酶，但从常规检测方法上很难判断木聚糖酶的性质是内切还是外切。所以要想应用检测方法去区别木聚糖酶的性质是内切还是外切必须从内切和外切性质本身入手寻找方法，根据木聚糖酶酶解的特性本文总结出以下几种方法。 2.1 间接测定法 2.1.1 酶解产物薄层层析对照法（TLC法） 标准品：木糖、木二糖、木三糖、木四糖；薄层板：硅胶G薄板；展层剂：正丁醇:吡啶:蒸馏水= 6 : 4 : 3；显色剂：邻苯二甲酸苯胺溶液；酶解产物的制备：在一定温度和pH条件下，应用木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖或单糖。 实验方法分析：木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖，再由β-木糖苷酶作用于低聚木糖的末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，将这些短链低聚木糖降解成木糖。而在薄层层析板上木糖的展距高于木二糖及二糖以上的低聚糖。由此，若将酶解产物在薄层板上展开时，如果酶制剂是内切酶则展距最多只能展到和木二糖标准品展距一样的高度，如果是外切酶则展距能达到木糖标准品展距的高度。 2.1.2 酶解产物高效液相色谱对照法（HPLC法） 标准品：木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖；酶解产物的制备：在一定温度和pH条件下，应用木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖或单糖。 实验方法分析：由“2.1.1”分析可知，若未知酶是内切木聚糖酶则酶解产物组分全部是低聚木糖,没有木糖，若未知酶是外切木糖苷酶则组分酶解产物大部分是木糖（如图2）。 2.2 直接测定法 2.2.1 β－D－1,4内切木聚糖酶活力测定方法 测定原理：通过将染色的小麦阿拉伯木聚糖与内切-木聚糖酶一起孵化，底物被降解为低分子量的染色片段，向反应液中加入甲基化酒精，低分子量的染色片段仍然保留在溶液中，通过离心可将高分子量底物除去，将上清液比色。根据标准曲线计算内切-木聚糖酶活力。 测定步骤：取0.5ml底物溶液于玻璃试管中，在40℃平衡5min；取0.5ml预平衡的酶液加入到底物溶液中，在用旋涡振荡器混合，在40℃水浴中孵化10min（从加入酶液开始精确计时）；加入2.5ml甲基化酒精(95%v/v)在旋涡振荡器上搅拌10S，以终止反应并沉淀未降解的高分子量底物；将反应液冷却到室温，再混合，然后在3000rpm离心10min；在590nm处测定上清液吸光度，根据标准曲线（以黑曲霉木聚糖酶和Azo-小麦阿拉伯木聚糖(Lot50201)制作）计算酶活性。 反应空白：在0.5ml底物溶液中加入2.5ml甲基化酒精(95%v/v)，然后加入0.5ml预平衡的酶液。一般空白在590nm处吸光度不超过0.05。 酶活计算：内切-木聚糖酶活力首先参照标准曲线将吸光度转化为mUnits/0.5ml，然后按下列公式计算： U/g=mUn