酵母RNA 的提取、鉴定和定量测定实验十.ppt

综合实验 酵母RNA的提纯及其定性鉴定 与定量测定 实验目的 1、学习RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。 3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。 4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。 5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。 Ⅰ 提纯部分 浓盐法提取酵母RNA Ⅱ 定性鉴定部分 一、RNA基团鉴定 二、电泳分离鉴定 三、光谱鉴定 四、纯度鉴定 Ⅲ 定量测定部分 一、地衣酚法定量测定 二、紫外吸收法定量测定 生物大分子物质提取的基本原理与步骤 一、材料选择与处理 二、细胞破碎 三、细胞器分离 四、提取 五、纯化 六、浓缩、干燥 七、样品保存 八、定性鉴定 九、定量测定 10、物质的利用 核酸的分布 DNA：细胞核（95%） 细胞器（5%） RNA：细胞质（75%) 细胞核(10%) 细胞器(15%) RNA以rRNA的数量最多（80％-85%) 核酸提取的主要步骤 破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子 去除其它不需要的核酸分子 沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质 核酸分离纯化原则 保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染 简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对核酸的破坏 减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) 减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力 、 高温) 防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶) 实验原理 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。 浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。 RNA提取方法方法与分类 稀碱法( 0.2% NaOH ) 浓盐法( 10% NaCl ) 苯酚法 氯仿-异戊醇法 去污剂法 盐酸胍法 三、试剂和器材 1、试剂 （1）干酵母粉 （2） RNA标准溶液（100微克/毫升） （8） 5%硝酸银溶液 （9）钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10% 硫酸中。 （10）地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入100毫克地衣酚。 （11） NaCl （12） 95%乙醇 （13） 6 mol/l HCl （14）高氯酸 （15）氯化锂 （16）硼酸缓冲液（pH-3.5） （17）磷酸缓冲液（pH-7.5） 2、器材 （1）电子天平 （2）电热套 （3）三角烧瓶 （4）烧杯 （5）高速冷冻离心机 （6）滴管（7）抽滤瓶 （8）离心管 （9）恒温水浴箱（10）吸量管 （11）紫外分光光度计 （12）表面皿 （13）量筒 (14）容量瓶 （15）擦镜纸 （16）比色皿 （17）玻棒 （18）定量滤纸 （19）试管 （20）布氏漏斗 （21）真空泵 （22）电泳仪 （23）紫外检测仪（24）可见光分光光度计 （25）托盘天平 （26）电泳槽 (27)0.5-5.0精密pH试纸 四、实验方法RNA的提取的操作 3、 RNA提取方法(浓盐法) 提取方案： ①取 12 g活性干酵母,置150 ml锥形瓶中，加入60 ml蒸馏水，混匀； ②倒入7 g NaCl，溶解后，沸水浴1 h； ③3500 rpm离心8 min，将上清倒入50 ml烧杯中， 4)用HCl调节pH，至2.0～2.5； ④将烧杯冰浴10 min； ⑤将烧杯中物质（含沉淀）移入离心管中， 3500 rpm离心8 min，弃上清，将沉淀移入10 ml烧杯中，95%乙醇5～10 ml洗