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蛋白质分离纯化与检测技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲双丙烯酰胺(Bis) 在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同分子的迁移率，当施加一定电压时小分子的物质的迁移速率将快于大分子的物质，即所谓的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品与上样缓冲液混合变性，上样缓冲液中含有SDS和巯基乙醇使得蛋白质分子中的二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按1.4g SDS/1g蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物。由于十二烷基磺酸根带负电，SDS覆盖于蛋白质的表面，破坏了蛋白质分子的四级结构而使多肽复合物具有近似的形状（长椭圆棒状），并且复合物所带有的负电荷大大超过了多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了多肽分子原有的电荷差别。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 如图所示，蛋白质所带的电性主要取决于氨基酸R集团所带的电性。图中的H代表无极性的R集团为了躲避水而聚集于内部。 当SDS结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物后， SDS均匀覆盖于蛋白质的表面，破坏蛋白质分子的疏水作用而成为线性分子。 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。在电泳时， SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。 试剂 30%凝胶贮备液： 含29%（W/V）丙烯酰胺 1% （W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺 10%SDS TEMED（N，N，N′，N ′-四甲基乙烯二胺） 10%过硫酸胺 Tris- 甘氨酸电泳缓冲液： 25mmol/L Tris 250mmol/L甘氨酸（pH8.3） 0.1%SDS 1.5mol/L Tris?Cl(pH8.8) 分离胶 1.0mol/L Tris?Cl(pH6.8) 浓缩胶 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15-20 104-105 5-10 105-2×106 2-2.6 蛋白质的分离纯化 Invitrogen ProbondTM Purification System 分离纯化原理 金属螯合层析：在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如Ni++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。 ProBond?是一种带有正电荷镍离子的琼脂糖树脂，带有6×His标签的蛋白与固定在ProBond?上的二价镍离子具有高度的亲和性，用某种与吸附蛋白质竞争结合的溶质洗脱亲和基质，特异性地将吸附的各种蛋白质分别洗脱下来。这类溶质包括含-NH2、-COOH、-SH等基团的物质和咪唑等取代剂。 操作流程 一、柱子的制备 二、蛋白的纯化 一、柱子的制备 将装有树脂的瓶子不断的颠倒轻敲，使树脂在瓶中重悬。 吸取2ml树脂加入纯化柱中，静置5-10分钟，通过重力使树脂沉淀在柱底；也可以通过低速离心（800×