15脂氧合酶1在胃癌细胞AGS中的表达.docVIP

15脂氧合酶1在胃癌细胞AGS中的表达 作者：林芬， 李建英， 陈丰霖， 陈治新， 王小众 【摘要】 目的 研究15脂氧合酶1(15LOX1)基因在人胃癌细胞AGS中的表达及其对AGS增殖凋亡的影响。 方法 通过脂质体介导瞬时转染15LOX1基因于培养的AGS中，逆转录PCR法和免疫印迹法检测15LOX1 mRNA及蛋白表达；四甲基偶氮唑盐法（MTT）、流式细胞术、AnnexinV/PI染色与原位末端标记法（TUNEL）比较转染前后AGS的增殖和凋亡情况。 结果 胃癌细胞AGS转染后表达有15LOX1的mRNA及蛋白。与非转染组及空质粒转染组相比较，转染重组质粒组AGS细胞生长明显受到抑制并且细胞周期停滞在G1期，其凋亡率明显高于非转染组及空质粒转染组。 结论 15LOX1基因能够抑制胃癌细胞AGS的增殖，并促进其凋亡。 【关键词】 花生四烯酸盐15脂氧合酶； 胃肿瘤； 肿瘤细胞，培养的； 细胞增殖； 细胞凋亡 15脂氧合酶1(15lipoxygenase1,15LOX1)是脂氧合酶同工酶的一种，是机体催化花生四烯酸生成活性分子从而影响细胞信号传导及代谢的关键酶，能够调节恶性肿瘤特别是上皮性肿瘤的存活。为了解15LOX1基因与胃癌的关系，本实验采用体外细胞系基因转染法，研究15LOX1基因转染对胃癌细胞增殖及凋亡的影响，以探讨该基因与胃癌发生 发展 的关系及作为基因 治疗 的候选基因的可能性。 1 材料与方法 1．1 试剂 重组15LOX1真核表达载体pcDNA3.1(+)/15LOX1由NIH的Eling博士惠赠，pcDNA3.1(+)表达载体由福建临床免疫研究所郑祥雄教授惠赠。质粒抽提试剂盒、逆转录试剂盒，脂质体转染试剂盒均购自美国Promega公司；RNA抽提试剂盒和AnnexinV/PI凋亡试剂盒购自深圳生物晶美公司；山羊抗人15LOX1多克隆抗体购于Santa cruz公司（sc27354）。 1.2 方法 1.2.1 重组pcDNA3.1(+)/15LOX1质粒转染AGS细胞 AGS细胞生长于含10%小牛血清的RPMI 1640中，以脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1(+)/15LOX1、pcDNA3.1(+)质粒转入细胞中，命名为AGS／15LOX1、AGS／pcDNA3.1细胞。步骤如下：选取对数生长期细胞，消化接种于25 cm×25 cm培养瓶，细胞数为1×106 L-1，待细胞贴壁，取无菌试管加入37 预热的无血清培养基2 mL，DNA 5 μg，TransFast Reagent 15 μL，立即涡旋混匀，室温下静置10～15 min。小心吸出培养细胞的培养基，稍涡旋混匀脂质体／DNA混合物，加入培养瓶中，37 孵育1 h，加入含血清的培养基4 mL，37 继续孵育48 h。 1.2.2 逆转录PCR法（RTPCR）鉴定15LOX1基因在转染细胞中的表达 分别抽提未转染AGS，AGS／pcDNA3.1,AGS／15LOX1 三组细胞总RNA，取RNA样品2 μg，42 60 min，99 5 min进行逆转录合成cDNA。 15LOX1引物（485 bp） 上游：5’GCTGGAAGAGAGAAGGAAGTTG3’ 下游：5’GAAGTCAGCTTCGAACAGTGTG3’ 内参βactin（776 bp） 上游：5’CTATTGGCAACGAGCGGTTC3’ 下游：5’CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT3’ 取1 μL cDNA进行PCR扩增（反应体系25 μL）。扩增条件：94 3min→94 ℃ 45 s→57 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min，25个循环；72 7 min。取8 μL PCR 产物，经1.2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/L溴化乙锭）中电泳分离,紫外灯下观察结果。 1.2.3 免疫印迹法（Western Blot）分析15LOX1蛋白在转染细胞中的表达 提取转染前后细胞总蛋白样品，Bradford比色法测定蛋白浓度。每孔25 μg蛋白上样,10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白印迹包括电转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗(1100)4 ℃过夜、二抗(15 000)室温轻摇60 min,用化学发光试剂盒进行蛋白信号检测。设βactin作为内对照。 1.2.4 MTT法检测15LOX1对AGS细胞增殖的影响 250 mg MTT溶解于50 mL PBS(0.01 mol／L pH 7.4)，过滤，4 避光保存备用。将AGS细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640稀释成1×104 mL-1，接种于96孔培养板，分别于培养24，48，72，96 h加入MTT 20 μL，继续