小硅藻光合作用脂13KG―4C稳定同位素定量标记分析.docVIP

　　小硅藻光合作用脂13KG―4C稳定同位素定量标记分析 摘要 以小硅藻（Nitzschiaclosteriumf.minutissima）作为研究?ο螅?利用超高压液相色谱联用四极杆静电场轨道阱高分辨质谱技术，研究了处于平台期的小硅藻中的光合作用脂被13C标记的程度和速度。结果显示：在平台期13C人工标记的10天内，所有4类光合作用脂均被13C明显标记，其中二酰甘油双半乳糖脂（DGDG）、磷脂酰甘油（PG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）被13C标记的总量，从刚进入平台期到平台期第8天逐渐增加，此后出现下降趋势，在第8天分别达到最大值（173±24）ng/mg，（473±41）ng/mg及（1224±21）ng/mg，标记率分别达到56.3%，38.4%和62.6%；而二酰甘油单半乳糖脂（MGDG）被13C标记的总量在整个平台期呈现持续上升趋势，并在第10天达到（956±51）ng/mg，标记率为87.3%。可见，不同脂质在藻体内合成的先后时间有差别，为了清晰地了解生物摄食过程中对微藻中特定脂类的同化机理，需要藻体内被13C标记的每类脂质含量的最大化，针对DGDG、PG、SQDG，应选取标记了8天的微藻来投喂生物，而针对MGDG，则应选取标记了10天的微藻投喂生物。 中国 8/vie 　　关键词小硅藻；13C稳定同位素；静电场轨道阱高分辨质谱；定量标记 　　1引言 　　微藻作为海洋生态系统的初级生产者，在海洋生物圈的能量流动和物质循环中发挥着极其重要的作用[1＼]。有些微藻营养丰富，富含多种不饱和脂肪酸如EPA、DHA等[2，3＼]，许多研究表明微藻是许多养殖生物特别是养殖贝类的优质饵料[4＼]。而微藻对养殖贝类的营养价值跟蛋白质、碳水化合物关系不大，主要体现在其脂类组成上[5＼]。与其它生物脂比较，微藻叶绿体的类囊体膜上有独特的脂类成分，其主要是单半乳糖甘油二酯（MGDG），双半乳糖甘油二酯（DGDG），硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）和磷脂（PG），这些统称为光合作用脂[6＼]。研究表明，不同微藻脂类组成不同，从而对养殖生物可能表现出不同的营养价值[7＼]。已有许多有关生物对微藻脂类的同化效果的研究报道[4，8＼]，但这些研究大多是针对微藻中脂肪酸、甾醇组成，有关生物对微藻中光合作用脂同化的研究报道还很少见。 　　对代谢途径研究，同位素示踪被认为是最明晰的技术手段。早在上世纪70年代，就有学者利用14C放射性同位素示踪研究脂类物质在海洋桡足类中的代谢[9＼]。而与放射性同位素相比，13C稳定同位素标记技术灵敏稳定，可用于长时间的示踪实验，又由于没有放射性同位素14C辐射的损伤，不会对所观测的过程带来扰动，近年来，该技术已经广泛应用于揭示物质在食物网中的循环路径和探究消费者之间的营养关系研究[10～12＼]，但这些研究大多是通过同位素比例质谱检测生物体内标记物同位素总量的变化，无法对特定脂类的同位素标记物进行跟踪监测。高分辨液相色谱质谱联用技术则可以通过多级质谱手段分析每一类脂上的同位素标记特性，近年来研究表明，稳定同位素示踪结合高分辨液质技术可以跟踪生物体内相关脂类合成代谢的变化，比如Li等[13]在含有被13C标记棕榈酸的细胞培养液中培养动物细胞，通过静电场轨道阱高分辨质谱（OrbitrapMS）技术探讨了动物细胞内磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）等脂质分子之间的转化规律，而Elizabeth等在缺氮条件下用无机13C对微藻脂类标记，通过高分辨质谱技术发现藻体内约60%的三酰甘油（TAG）是从头合成的而非藻体内其它成分转化而来，且磷脂酰胆碱（PC）的极性头部来自甜菜碱脂（DGTS）的转化[14＼]。 　　因此，也可通过对微藻进行13C稳定同位素标记后投喂生物的方法，跟踪生物对不同脂类的同化以探究生物体对微藻中不同光合作用脂的代谢机理，这就需要首先考察微藻中不同脂类被13C稳定同位素标记的速度和程度。本实验以小硅藻（Nitzschiaclosteriumf.minutissima）为研究对象，利用13C稳定同位素和超高压液相色谱联用四极杆静电场轨道阱高分辨质谱技术，建立了小硅藻平台期光合作用脂被13C稳定同位素人工标记方法，为探究生物对微藻脂类生物标记物的同化及对微藻体内脂质的富集提供了明晰的技术手段。 　　2实验部分 　　2.1仪器和试剂 　　UltiMate3000超高压液相色谱分析系统，QExactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪，HypersileGoldC18色谱柱（100mm×2.1mm，1.9μm），ThermoScientificXcaliber数据分析系统（美国ThermoFisherScientific公司）；超纯水系统（法国Milli