SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意.docVIP

3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？ 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。 5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？ 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？ 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。 11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？ 横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。 12. 什么成分会影响 2D 胶的效果？ 核酸，盐，去垢剂等等。 13. 2D 胶的上样量应该在什么范围？ 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。 14. 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？ 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（ 不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化