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实验二 氨基酸的分离鉴定 纸层析法 【实验目的】 1.通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 2. 掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定） 。 【实验原理】 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，是分配层析的一种。在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的： 实验仪器 1．层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗 2．毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱 3．层析滤纸、手套 、透明胶带或针线 实验材料和试剂 1．氨基酸溶液　分别配制0.5%的Lys、Alu、Ile、Met溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。 2．显色剂　0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 3．扩展剂（展层剂） 　酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制30ml 　碱溶剂系统：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3（体积比），平衡溶剂为12%氨水。 实验流程 1．将盛有扩展剂10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。 2．戴手套取层析滤纸一张作标记。 3.点样 干后重复点一次，直径最大不超过3mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约20～30分钟。 4.展层　用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。上沿约1厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。 5.显色　用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，烘箱（65℃）5分钟或用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有α－氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。 实验结果与讨论 注意事项 1．切勿用手直接接触滤纸和显色剂。 2.点样过程中必须在第一滴样品干后再　　点第二滴。 3．使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 * * 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、PH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 Rf＝ 溶剂前沿 层析点 原点 溶剂前沿 亮 苯丙 缬 脯 赖 *