水通道蛋白1、3在糖尿病心肌病大鼠心肌组织的表达及意义.docVIP

水通道蛋白1、3在糖尿病心肌病大鼠心肌组织的表达及意义 作者：王海英 高宇 高长斌 王清 【摘要】 目的 探讨水通道蛋白1、3 (AQP1、3)在糖尿病心肌病状态下的表达及生理作用。方法 取糖尿病心肌病模型大鼠心肌组织及正常大鼠心肌组织，应用免疫组织化学方法检测AQP1、AQP3 在心肌组织中的表达及分布。结果 AQP1、AQP3广泛分布于正常及糖尿病心肌组织中，糖尿病心肌较正常心肌的免疫组化阳性指数有所降低(P0.05)。结论 AQP1、3在糖尿病心肌病心肌组织中的表达较正常组织降低，可能在糖尿病心肌病的发生和 发展 中发挥重要的生理作用。 【关键词】 水通道蛋白;糖尿病心肌病;心肌 水通道蛋白(AQPs)是与转运水有关的一系列具有同源性的内在膜蛋白家族，广泛存在于动植物和微生物中，在机体不同组织和部位执行着不同的生物学功能。AQP家族成员在泌尿、呼吸、神经、消化等系统的组织定位和生理功能研究已取得了一定进展〔1，2〕，但AQPs在心肌组织的研究甚少，尤其在糖尿病心肌病状态下的表达和生理功能缺乏系统研究。本研究在建立糖尿病心肌病大鼠模型基础上，通过检测AQP1、3在心肌组织的表达，进一步了解AQP1、3与糖尿病心肌病的关系。 　 　1 材料与方法 　　1.1 动物与主要试剂 雌性4周龄Wistar大鼠60只，体重(200±10)g，购自吉林大学实验动物中心。链脲佐菌素(STZ )购自美国Sigma 公司;心肌酶试剂盒、即用型SABC试剂盒购自北京中山生物科技股份有限公司;AQP1、3兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 大鼠糖尿病心肌病模型复制 60只大鼠随机分为糖尿病大鼠 (DMR，35只 )和正常大鼠 (CTR，25只 )。参照 文献 方法〔3〕，DMR给予高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、70%常规饲料)喂养,4 w末给予STZ 25 mg/kg (用枸橼酸钠缓冲液溶解，pH4.5)腹腔注射，每周重复1次，再连续4 w，CTR仅给予枸橼酸钠缓冲液(pH4.5)腹腔注射，末次血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型动物。DMR继续高糖高脂饲料再喂养6 w。 　　1.2.2 生化指标测定 血糖使用强生血糖仪经尾静脉采血测定。心肌酶〔天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、肌酸磷酸激酶 (CK)、乳酸脱氢酶 (LDH)〕由全自动生化分析仪测定，按试剂盒说明书进行操作。 　　1.2.3 心肌组织病 理学 检查 按照常规病理学方法进行固定、包埋、切片，将切片作HE染色。 　　1.2.4 心脏组织免疫组织化学染色 标本以 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。石蜡切片用梯度酒精脱蜡至水后，0.01 mmol/L PBS洗2次，滴加3%过氧化氢，室温孵育10 min，PBS洗3次，切片置修复液中微波炉加热10 s，PBS洗2次。滴加封闭液，置于湿盒中封闭60 min，分别加入1100稀释的AQP1、3多克隆抗体(抗)，4过夜。用PBS洗3次后滴加SABC试剂免疫组化染色，DAB显色，苏木素轻度复染，封片。阴性对照组用未被免疫的兔血清1200稀释，替代抗，余步骤同上。所有切片在光学显微镜下观察，取染色良好(阳性细胞染色清晰、背景染色很低)的组织切片进行照相，并在低倍镜下找到阳性细胞较为密集的区域，图像分析系统测量AQP1、3阳性产物面积及阳性产物强度灰度值，然后将上述数值依据赵景民等〔4〕的方法转化成免疫组化阳性指数，即:免疫组化阳性指数=阳性面积/测量组织面积×阳性强度灰度值，取其平均值(x±s)作为阳性细胞表达率。 　　1.2.5 判定标准 AQP1、3阳性细胞以细胞核和细胞质染成棕黄色为阳性结果。 　　1.3 统计学处理 使用SPSS10.0软件，计量资料以x±s表示，采用t检验，进行组间比较。 　 　2 结 果 　　2.1 心肌酶的变化 第14周末检测血清CK、LDH、AST的水平，DMR组血清CK、LDH、AST的水平均显著高于CTR组(P0.01)。见表1。表1 两组大鼠血清心肌酶的变化( 　　2.2 心肌组织的病理组织学变化 CTR组心肌纤维、心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀。DMR组心肌细胞排列紊乱，细胞核大小不规则，纤维断裂，部分胞浆浓缩深染。见图1。 　　2.3 AQP1、3在心肌分布的变化 AQP1 在CTR组的心肌组织主要分布于血管内皮细胞、心肌细胞的胞膜上，以血管内皮细胞最为明显;在DMR AQP1的特异性染色明显减少。AQP3 在正常大鼠心肌中分布于心肌细胞的胞膜上，在糖尿病心肌中较正常心肌的特异性染色明显减少。见图2。 　　2.4 免疫组化阳性指数比较 DMR组心肌组织血管及上皮细胞AQP1表达的阳性指数较正常心肌组织明显