基因重组技术概述幻灯片.pptVIP

DNA重组技术前言 （1）I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。 功能 核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶 特点： 识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点 随机切割 不产生特异片段  DNA重组技术 DNA重组技术： 按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞 中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 （二）DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 特性：具有3种酶活性 5’ 3’外切功能 3’ 5’ 外切功能 聚合酶功能 5’ CCG 3’ GGCTATCGA5’ 聚合酶 dATP dTTP dGTP dCTP 5’ CCGATAGCT3’ 3’ GGCTATCGA5’ a.5’?3’DNA聚合酶活性 底物：单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物 5’ CCG3’ 3’ GGC5’ 聚合酶 5’ CCGATAGCT3’ 3’ GGC5’ A T A G C T b.3’?5’外切酶活性 底物：带3’羟基的双链DNA或单链DNA、从3’羟基端降解DNA。对双链DNA链的外切核酸酶活性可被5’?3’DNA聚合酶活性所封闭。 c. 5’?3’外切酶活性： 能从游离的5’末端降解DNA成为单核苷酸。 5’ CCGATAGCT3’ 3’ GGCTATCGAAT5’ 聚合酶 5’ CCGATAGCT3’ 3’ GGCTATCGA5’ T A TA （2）Klenow片段 从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除5’?3’外切酶活性，即得Klenow片段。 其只具有 5’?3’聚合酶活性   3’?5’外切酶活性  35kD 76kD 苦草杆菌蛋白酶裂解全酶 5’ 3’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 Klenow片段 DNA聚合酶I全酶 应用1.催化DNA切口平移反应，置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I） DNaseI DNA聚合酶I dNTP 32P-dNTP 2.对DNA分子进行末端标记（Klenow） 2 .Taq DNA聚合酶(1)特性： ①耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。 ②5’?3’聚合酶活性  ③5’?3’外切酶活性 ④最佳作用温度为75-80?C （2）用途①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增 ②对DNA进行测序 3.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）（1）特性①催化从RNA为模板的DNA聚合反应 ②具3’?5’RNA外切酶活性，能特异性降解RNA— DNA杂交分子中的RNA部分 ③具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能 ④能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA）  （2）分类 ①禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV）  具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性  无3’?5’外切酶活性。 温度42?C  pH8.6时活性较高 ②鼠源反转录酶 来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性 无3’?5’外切酶活性 温度37?C pH7.6时活性较高  4.末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶） 催化dNTP加到DNA分子的3’羟基端 3’末端标记 添加多聚体尾 （三）DNA连接酶1.定义：DNA Ligases are primarily responsible for joining the gaps that form in DNA during replication(i.e., the joining of Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging strand replication), DNA repair, and recombination. 催化双链DNA一端的3’OH与另一双链DNA5’的