高GC含量DNA的PCR.pptVIP

PCR Amplification of Highly GC-rich Regions 高GC 含量DNA序列扩增困难 生物中广泛存在高GC 含量DNA序列,扩增的DNA有的含70%-80%高GC,常规PCR条件下,难扩增,原因: 易形成复杂的二级结构, 防止DNA模板变性,DNA聚合酶难以结合. 高GC 含量DNA序列扩增常遇到的问题 1. 常规PCR. 影响PCR产物合成. 多重 PCR. 偏好低GC区扩增导致PCR产物比例失衡. 定量 PCR.富GC区易与内标形成异源双链核酸分子,导致PCR结果解释错误. DNA测序. DNA聚合酶趋向于在富GC区停留使测序难以进行. cDNA合成. 合成的是缺GC区的短的cDNA片段. 高GC 含量DNA序列扩增方法 1.模板DNA变性处理 1) NaOH:◆ 2)核苷酸类似物: dITP脱氧黄嘌呤, dGTP(7-脱氮- 2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸) 3)有机添加剂:二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺、 甜菜碱(betaine）、甘油、四甲基亚砜、酰胺、 聚已二醇（PEG) 2.使用热启动聚合酶和高Tm引物 它们的特异性比普通 Taq polymerases高,如. Tag 加 Pfu, Deep Vent, NaOH 模板DNA在碱性溶液里不被降解