DNA连接反应步骤及说明.docxVIP

快速DNA连接试剂盒 概述: ????克隆中两个重要步骤包括外源DNA与载体的连接和重组DNA的转化。连接反应是通过连接酶完成 的，连接反应需要ATP和镁离子催化双链DNA的3’-OH和 5’-P形成磷酸二酯键。DNA末端可以是 粘末端，也可以是平末端。粘末端连接反应效率高于平末端连接效率。因此，在连接平末端分子时DNA 浓度要高于粘末端分子连接反应的DNA浓度。PEG可以使T4 DNA连接酶对平末端和粘末端连接效率 得到提高[Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983]。由于PEG可以辅助提 高连接效率，该试剂盒对于粘末端和平末端的连接只需十分钟即可完成。试剂盒中提供独特的5×Rapid Ligation Buffe，专为提高DNA连接效率设计。高的PEG浓度可以提高连接反应效率但却会使转化效率 降低，因此应该对PEG浓度进行优化。该试剂盒中优化的PEG浓度同时保证了高的连接效率和转化效率。 目录号规格价格LINK-30 30次180元保存：　试剂盒中所有组分需-20℃保存。请不要用其它试剂替代该试剂盒中的反应缓冲液。 试剂盒包装组成：　　 ??? 该试剂盒中提供的试剂可以完成30×20μl DNA连接反应。 试剂盒组成规格( 30 reactions )T4 DNA ligase30μl5×Rapid Ligation Buffer (5x RLB)200μl特点:　　室温（20-25℃）连接10-30 min。 存储缓冲液： ????10 mM Tris-HCl (pH 7.5)????50 mM KCl????1 mM Dithiothreitol????50% Glycerol 质量控制：　　??试剂盒中提供的T4 DNA连接酶没有检测到外切核酸酶或内切核酸酶活性。另外每一批连接酶都通 过SDS聚丙烯酰胺凝胶检测蛋白污染（低于5%）。 ·核酸外切酶污染检验 T4 DNA连接酶与1mg经超声波处理的3H标记的E.coli DNA (105cpm/mg)在50ml反应体系中，采 用随酶提供的Rapid Ligation Buffer，37℃温育4小时。通过三氯乙酸（TCA）沉淀DNA，然后计算上清 液的放射活性。通过计算上清液中被标记的总DNA放射活性，进而可以显示出核酸外切酶活性。检测出外切酶活性低于0.1放射活性，这种方法可检测出的底线是0.05%。 ·核酸内切酶检测 在50μl反应体系里，T4 DNA连接酶与1mg超螺旋质粒DNA 37℃温育4小时，用琼脂糖凝胶电泳 检测，只有0.1%转变为缺口或线性质粒DNA。 操作步骤：　DNA片段克隆到质粒载体上 　我们推荐载体与插入DNA的摩尔数比例为1:1或1:3。最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同， 例如cDNA和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算插入DNA用量：? [实例]: 　??载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为： 1.在一个PCR薄壁管中加入下列成份： 载体DNA100ng插入DNA25ng5×RLB4μlT4DNA连接酶1μlddH2O至20μl 2. 室温温育十分钟 3. 将连接反应液与感受态细胞做转化。(感受态效率：1×107) 线性DNA重新环化： ????在重新环化反应中DNA的量十分重要。同DNA片段克隆到载体相比，较低的DNA浓度有利于增强 重新环化，因为低的DNA浓度有利于分子内部的连接（重新环化），而抑制分子之间的连接。[实例]：1.在一个PCR薄壁管中加入下列成份： 载体DNA20~30ng5×RLB4μlT4 DNA连接酶1μlddH2O至20μl2. 室温温育十分钟。 3. 将连接反应液与感受态细胞做转化。(感受态效率：1×107) 接头连接反应：　　 接头（8 个碱基或者更长）连接反应条件同 DNA片段与质粒载体连接相同。但是如果接头的长 度小于8个碱基或者GC含量较低，那么连接反应 应该在16℃进行 30分钟到2小时。我们推荐载体/ 接头摩尔比为： 脱磷酸化载体：磷酸化接头＞1:100 [实例]：　　 1. 在一个PCR薄壁管中加入下列成份： DNA片段100ng接头25ng5×RLB4μlT4 DNA连接酶1μlddH2O至20μl2. 16℃温育1小时 3. 将连接反应液与感受态细胞做转化。 （感受态效率：1×107）在接头连接反应中70℃十分钟可以使T4 DNA