SDS-PAGE与Western blotting实验设计.docVIP

SDS和Western blotting法测脊髓细胞内Caspase-3 【前言】 1.关于SDS（十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳）： ⑴发展历程：SDS技术，SDS（十二烷基磺酸钠），以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术最初由hapiro于1967年建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。SDS是一种阴离子剂SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物（一种形似“雪茄烟”的长椭圆棒，其短轴长度相等），这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异和结构差异，由于SDS与蛋白质的结合是和蛋白的分子量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶。SDS以此为支持物进行电泳一般采用的是不连续缓冲系统不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。样品浓缩胶，被浓缩至一个狭窄的区带。 进入分离胶，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质受到较大的阻力而滞后，这样蛋白质在电泳过程中就被分离。它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Caspase-3 是Caspase 家族的一员,是哺乳动物细胞凋亡的关键酶。Caspases家族是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。）M,pH8.8,Tris-HCl）：Tris(三羟甲基氨基甲烷，为碱性)18.15g，1mol/lHCl 24ml，加水至100ml，4℃保存一个月。配制后用pH试纸测试pH为8.8。③浓缩胶缓冲液（0.5 M,pH6.8Tris-HCl）：Tris 6.057g,1M HCl 48ml,加水至100ml。配制后用pH试纸测试pH为6.8。④10%SDS(十二烷基硫酸钠)SDS 10g，加水至100ml。⑤上样缓冲液（3×SDS，-20℃分装保存）用于消化蛋白使其一级结构暴露。至少1：4稀释样品，100℃煮5min。 浓缩胶缓冲液1.0ml, SDS(10%)1.6ml，β-巯基乙醇（β-ME）0.4ml，50%甘油 (纯甘油0.4,水0.4) 0.4ml， 1%溴酚兰(4℃ store) 0.4 ml，双蒸水3.8ml。⑥过硫酸胺(APS)，现用现配，用量少，APS0.1g加水1ml,可放置一周。⑦5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g，甘氨酸188g，SDS10g蒸馏水溶解至2000ml, 临用前稀释5倍。⑧10×TBS:Tris60.57g,Nacl 87.66g,浓 HCL33ml,加 H2O至1000ml 调pH至7.4。⑨TBST：10×PBS 100 ml， 加0.5ml Tween-20 (0.5%)，加水至1000ml，调pH至8.0。⑩转印缓冲液：Tris 3.033g , Gly14.42g, 甲醇200ml, 加水至1000ml 用2次。（或 Tris 12g , Gly 57.6g ,甲醇800ml, 加水至4000ml）。 2.2.2分离胶与浓缩胶的配制方法： 表1 分离胶和浓缩胶