northern blot的实验流程.docVIP

按大小分离RNA:在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳 1. 试剂及其配制甲醛（37%溶液，1.3mol/L） 将41.8g的MOPS溶解于700ml灭菌的DEPC处理的水中，用2N的NaOH调整到pH值为7.0。 加20mlDEPC处理的1mol/L的乙酸钠和20ml DEPC处理的0.5mol/L EDTA（pH=8.0），用DEPC处理的水将溶液的体积调整到1L。 通过一个 0.45um的微孔滤膜过滤灭菌溶液，同时，将其在室温下避光贮存。 4） RNA Loading Buffer (+EB)：TaKaRa 2．配制含有2.2mol/L 甲醛的琼脂糖凝胶（100ml 1.5%) 称量0.375g 琼脂糖到18ml灭菌水中,用微波炉法溶解琼脂糖，将溶液冷却至55℃。 加入2.5ml 10×MOPS电泳缓冲液，4.5ml去离子甲醛，在化学通风橱中灌制凝胶。 处理样品以及RNA marker 向4μl的RNA样品（RNA maker同理）中加入4μl RNA loading buffer，震荡混匀厚稍离心，然后65℃水浴10min，速冷后即可使用。 电泳 电泳槽中加入1×MOPS缓冲液，于4~5V/cm电压下电泳，大约1h左右。 变性RNA在膜上的转移和固定 1 转移胶的制备： 用DEPC处理的水淋洗胶。 将胶浸入5倍体积的0.01mol/L NaOH-3mol/L NaCl中20min。 将凝胶转移至一个玻璃干烤皿内，用锋利的刀片修去凝胶的无用部分以保证胶与膜对齐。 用长和宽均大于凝胶的玻璃板作为平台，将其放在大干烤皿内，上面放一张滤纸。 于干烤皿内倒入相应的转移缓冲液（带正电荷的膜用0.01mol/L NaOH-3mol/L NaCl）直至液面略低于平台表面，当平台上方的滤纸完全湿透后，用玻璃棒或移液管赶走所有的气泡。 2 转移膜的准备： 裁剪和胶一样大小的尼龙膜。 将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至全部湿透，然后讲膜进入10×SSC中至少5min。 3 转移系统的安装和RNA的转移： 将胶倒转后置于平台上的滤纸中央，确保滤纸和胶之间无气泡。 用保鲜膜围绕凝胶周边，而不是覆盖凝胶。 在胶的上方覆盖湿润的尼龙膜，并确保胶与膜之间无气泡。 用相应的转移缓冲液浸湿两张与胶大小一致的滤纸，放于湿润的尼龙膜上，用玻璃棒赶走所有气泡。 剪一叠5~8cm厚，略小于滤纸的纸巾，放于滤纸之上，在放一块玻璃板，然后压上400g重物。 转移过夜。 拆除毛细管转移系统，用铅笔标明膜的正面，将膜转移至50ml 6×SSC中，于摇床上室温轻摇5min。 从6×SSC溶液中取出凝胶，将多余的液体沥干后，将膜的RNA面向上放置于干的滤纸上数分钟。 4 RNA固定在带正电荷的尼龙膜上： 待膜在空气中晾干后，将干燥的膜夹在两张滤纸之间，120℃烤30min DIG-DNA标记以及纯化 标记探针： 加入1μg的模板的DNA，然后加入ddH2O到16μl。 通过煮沸10min使DNA变性然后快速放入冰浴10min（完全变性对于有效标记探针很重要）。 混合DIG-High prime并加入4μl到变性的DNA中，混合并简单离心，37℃孵育2hr。 停止反应：65℃水浴10min。 探针纯化（Mini Column DNA fragment）： 抖动mini spin，使其中的凝胶混匀，打开标帽，去掉帽尾。 将mini spin放入一个Eppendorf管中，1000g离心1min。 取新的Eppendorf管，将mini spin放入管中，将标记好的探针点在凝胶中央，1000g离心1min，收集离心后的液体。 预杂交及杂交 预杂交：预杂交液5ml预热到42℃，将膜放入杂交瓶中，温育膜2hr。 将预热的42摄氏度杂交液5ml放入密闭的塑料袋中，加入探针约250ng（每ml杂交液中50ng探针），混匀。将预杂交后的膜转移到密闭塑料袋中，42℃杂交过夜。 洗膜 杂交后，将膜迅速转移至足够的2×SSC，0.1%SDS中连续震荡两次，每次5min。 在68℃，用足够的0.5×SSC，0.1%SDS（提前预热到洗涤温度）连续震荡两次，每次15min。 免疫检测（地高辛杂交检测试剂盒Ι） 制备试剂盒工作液 溶液 组分/制备 阻断液 用顺丁烯二酸缓冲液1:10稀释10×阻断液，制备成1×工作液 抗体溶液 每次使用前，需10000rpm离心抗Dig-AP酶结合物5min，从表面小心吸取所需的量。用阻断液按1:5000稀释抗体 显色底物液 加200μl NBT/BCIP到10ml检测缓冲液中 步骤 在杂交和严谨洗涤之后，在洗涤缓冲液中浸润5min。 在10ml阻断液中孵育30min。 在10ml抗体溶液中孵育30min。 在10ml洗涤缓冲液中洗涤2次，每次15min。