0细胞生物学研究方法.pptx

第二章 细胞生物学研究方法 ;光学显微镜（light microscope ） 电子显微镜（electron microscope）;Figure 3-1. Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes. ;尼康E-600显微镜 ;Light Pathway of Microscope;普通显微镜最大放大倍数1000－1500倍 因为它的分辨率有限，再放大也是空放大; ;;普通光学显微镜;组织切片的制备;1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。 2.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。 3.脂质染色剂：苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。;有丝分裂中期固定的洋葱根尖细胞中，福尔根染色的结果， 特异显示DNA;1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。 2.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。 3.脂质染色剂：苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。;（二）紫外线显微镜（ultraviolet microscope） 根据光学原理，光源光波越短，显微镜的分辨本领越大。紫外线显微镜以紫外线为光源，分辨率可提高一倍。 可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。 可用来测定细胞中的核酸含量。 透镜：石英、萤石（CaF2)、碳酸锂等制作。 价格昂贵，使用受限。;（三）荧光显微镜（fluorescent microscope） 20世纪40年代在紫外线显微镜基础上发明。 原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受激发光照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经过照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。;结构：在普通光学显微镜上添加一些附件： A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。 B.滤片：根据性能分为两组。 一是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。 二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。;荧光显微镜;（四）暗视野显微镜（dark field microscope） 原理：显微镜加装挡光片，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜 特点：视野的背景是暗的，样品的边缘是亮的。 特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑;（五）相差显微镜（phase contrast microscope） 相差显微镜由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成明暗差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 ;构造： 聚光器或光源上安装环状光阑(annular diaphragm)； 在物镜中加了环形相板(annular phase plate)。 主要用于观察活细胞或活组织，是体外细胞和组织培养工作的重要工具。;相差显微镜;（六）微分干涉相差显微镜（differential interference contrast (DIC) microscope ） 1952年，Normaski在相差显微镜原理的基础上发明。 能显示结构的三维立体投影影像。; 分离的有丝分裂纺锤体 左、微分干涉显微镜；右、相差显微镜； ;（七）激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope） 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，图像以电信号形式记录。 由于激光束的波长较短，光束很细，有效排除焦点以外的光信号干扰，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 激光共聚焦扫描显微镜随时采集记录信号，既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。 ;laser confocal scanning microscope