硝酸甘油对肿瘤生长与转移调控的研究.pptVIP

硝酸甘油对肿瘤生长与转移调控的研究 姜辉 田亚平 董衿 张国庆 宋淑珍 姜楠 解放军总医院生化科，北京100853 PART ONE 细胞培养与药物处理 Hela细胞为人宫颈癌细胞株，解冻后培养于含10%胎牛血清和青链霉素的1640培养液中,置于37℃、5%CO2培养箱中传代培养。在实验中将细胞随机分为两组,即实验组(加入GTN)和对照组，每组细胞数均为107个。 GTN孵育液由含10%胎牛血清1640培养液配制，浓度为40μg/ml。在分组接种后，在实验组加入含GTN的培养液10 ml，置培养箱内避光孵育48h。对照组直接加入不加GTN的培养液10 ml。 细胞RNA质量的影响：GTN处理后RNA溶液浓度为0.848μg/μl，D(260)/D(280)为2.141；对照组抽提获得溶液浓度为1.24μg/μl，D(260)/D(280)为1.950。实验组RNA浓度明显低于对照组,但RNA质量符合实验要求。 基因芯片检测分析显示，GTN处理后基因表达发生改变。其中22条改变明显（Exp2/ Exp12或者0.33 ）。 Exp2/ Exp12的基因数为7条，Exp2/ Exp1 0.33的基因数为15条(68%) 。 PART TWO 细胞培养与药物处理 Hela细胞为人宫颈癌细胞株，解冻后培养于含10%胎牛血清和青链霉素的1640培养液中,置于37℃、5%CO2培养箱中传代培养。在实验中将细胞随机分为两组,即实验组(加入GTN)和对照组，每组细胞数均为107个。 GTN孵育液由含10%胎牛血清1640培养液配制，浓度为40μg/ml。在分组接种后，在实验组加入含GTN的培养液10 ml，置培养箱内避光孵育48h。对照组直接加入不加GTN的培养液10 ml。 双向电泳图谱分析显示，给药组Hela细胞总蛋白与对照组总蛋白匹配率为86%。发现若干表达量增加、降低或新出现的差异表达的蛋白质点。 差异蛋白的放大、差异蛋白点的等电点、分子量和相对含量及增减的比率见以及GTN给药组相对于对照组新表达以及完全没有表达的蛋白点分析见下列图表。 PART THREE C57小鼠，雄性，22～24g，随机分为4组，每组10只。 采用相同剂量不同浓度的硝酸甘油溶液，其中高浓度为1.6mg/ml、中浓度0.5mg/ml、低浓度0.16mg/ml，灌胃0.4ml/日/只，连续10天。 于21日处死对血中NO3－含量和生化指标进行测定，并观察原位瘤重。 讨论与展望 恶性肿瘤的诊治研究一直是医学领域的热点问题，有关研究一直在努力寻找新的更加灵敏的肿瘤标志物和治疗方法，近年来发现肿瘤的形成发展和转移都与肿瘤的血管形成密切相关，抑制肿瘤血管形成也成为治疗肿瘤的新的途径。在芯片的检测的基因中，一些基因如MMP-9和Heparanase与肿瘤发展呈正相关，在肿瘤发展侵袭过程中表达明显增高，并与恶性度分级相关，在肿瘤切除或受到抑制时,基因表达水平明显下降 。 实验方法 样品处理：将养有细胞的培养瓶中的培养液倒掉，加入1 mlEDTA清洗吹打数次后吸出；然后再加入1.5 mlEDTA溶液用细胞刮刀刮掉贴壁的细胞，并洗涤吹打培养瓶后吸出放入冻存管。将细胞离心1000rpm,10min，去上清留沉淀然后加入裂解液（Tris 40mM，尿素7M，硫脲2M，4% CHAPS，二硫苏糖醇50mM，1%IPG buffer 1.5%），每107个细胞加150μl裂解液，液氮快速冻融3次，再加入DNA、RNA酶，0oC水浴20min，离心1000rpm 30min，最后收集上清，-20oC保存。 蛋白质定量：应用0.5mg/ml标准牛血清白蛋白(BSA)和待测蛋白样品进行紫外分光光度比色，测定标准浓度蛋白和测量待测样品的A595比色值，取标准蛋白浓度测定作标准曲线，结果浓度通过标准曲线进行计算。 实验方法 主动重泡胀：根据样品测定浓度取200ug蛋白，加入DTT20ul、IPGbuffer4.5ul，再加入重泡胀液(5mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，溴酚蓝trace)至总量350 ul，离心104rpm/min×5min。离心后取上清液加于IEF电泳槽中，用镊子赶气泡后，取出IPG干胶条（17cm,PH3～10），撕去保护膜，捏头尾胶面向下放入槽中，保证全湿，加入覆盖矿物油2ml并赶出气泡，盖扭反盖。加以50V电压,重泡胀16h。 第一相，等电聚焦：将准备好的IEF电泳槽放入IPGphor等电聚焦仪电极板上，主动重泡胀和等电聚焦在20℃ 自动进行，总电压时间积100～120kvh，其中聚焦时间为60kvh。 SDS平衡及第二相，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：等电聚焦后于平衡液Ⅰ中平衡15min再于平衡液Ⅱ中平衡15min。平衡