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凝胶渗透层析法 溴酚蓝Kav值的测定 一、什么是凝胶渗透层析法 二、什么是凝胶 葡聚糖凝胶 三、原理 离子交换层析 一、什么是离子交换和离子交换层析 ● 离子交换层析是用离子交换剂作为固定相，具有不同酸碱性质的物质，它们带有不同性质的电荷或者电荷量不同，在流经固定相时，有的离子能与交换剂以静电引力相结合，有的不能，或者是结合的紧密程度不同，基于电荷不同的不同物质对离子交换剂有不同的亲和力，通过改变洗脱剂离子强度和pH值，控制这种亲和力使这些物质按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来，由此将各组分分开的方法。 二、离子交换剂（ion exchager） 离子交换剂是一类具有活性基团的荷电固相 颗粒 R-SO3-H+ R为惰性载体，不溶于水，多为高分子的聚合物，又称为母体。 SO3-为荷电活性基团，R与SO3-之间以共价键相连，。 H+为平衡离子，与SO3-之间以静电引力相互作用，可被溶液中带相同电荷的离子所置换。 离子交换剂的必备条件 具有不溶性。 能使离子在交换剂的结构中扩散得相当容易， 离子能够自由的进入交换剂而进行交换。 含有相当数目的可交换基团。 有很稳定的化学性质与物理性质。 离子交换剂分类 ● 根据不溶母体不同，分为三大类：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶（包括葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶）。 ●根据平衡离子的电荷性质又可分为两大类，即阴离子交换剂和阳离子交换剂。 离子交换树脂 ●分为强酸型，中强酸型和弱酸型三类 强酸型树脂含有磺酸基团（R-SO3H） 中强酸型树脂含有磷酸根（—PO3H2），亚磷酸根（—PO2H2）或磷酸基（—O—PO2H2） 弱酸型树脂含有羧基（—COOH）或酚羟基 离子交换树脂 ●可分为强碱型，中强碱型和弱碱型三类 强碱型树脂为季胺盐[—N+（CH3）3] 中强碱型树脂为既含强碱型基团，也含弱碱性基团的 弱碱型树脂有叔胺[—N（CH3）2]，仲胺[—NHCH3]和伯胺（—NH2）类 离子交换纤维素 ●它具有松散的亲水性网状结构,有较大的表面积，大分子可以自由通过。因此对生物大分子来说，它的交换容量比离子交换树脂大。 离子交换容量是衡量离子交换剂交换能力的重要指标，它是指每单位重量离子交换剂中可解离基团的数量。它是离子交换剂的特性，与操作条件无关。 交换容量常用单位重量（干交换剂g）或单位容积（湿交换剂ml）的交换剂所能交换的毫克当量离子来表示，即毫克当量/克（meq/g）或毫克当量/毫升（meq/ml）。 离子交换纤维素 ● 分辨率高，分离效果好 ●纤维素的洗脱条件温和，不影响生物大分子的构型 ● 样品回收率高 同时具有分子筛效应，分辨率进一步提高 葡聚糖凝胶（Sephadex gel）作为离子交换剂母体，再引入不同的交换基团，制成了各种类型的 对生物活性物质是一个十分温和的环境 由于它能引入大量活性基团而骨架不被破坏，交换容量很大 其外形呈球状，装柱后，流动相在柱内流动的阻力较小，流速理想 离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶 DEAE-Sephadex A-25 A-50 弱碱性阴离子交换剂 DEAE（二乙基氨基乙基） Cl- DEAE-Sepharose 4-B 6-B 弱碱性阴离子交换剂 DEAE（二乙基氨基乙基） Cl- CM-Sephadex C-25 C-50 弱酸性阳离子交换剂 羧甲基 Na+ CM-Sepharose 4-B 6-B 弱酸性阳离子交换剂 羧甲基 Na+ QAE-Sephadex A-25 A-50 强碱性阴离子交换剂 二乙基（二羧丙基）氨基乙基 Cl- SP-Sephadex C-25 C-50 强酸性阳离子交换剂 磺丙基 Na+ 三、离子交换层析全过程 1.带有正性荷电活性基团的结合着平衡离子的阴离子交换剂 2.样品物质将要进入离子交换床，其中含有带正电物质、不带电物质、和带负电物质 3.带负电样品物质逐渐与平衡离子发生置换反应并结合到离子交换剂上而带正电和不带电物质不发生置换反应。 4.离子交换剂与带负电样品物质结合，而中性及带正电物质流出层析床 5.增加洗脱离子的浓度准备取代样品物质。 6.洗脱离子把带负电的样品物质置换下来，使其流出层析床。 四、洗脱 将离子交换剂中结合的带相反电荷的溶质离子（样品离子）洗脱，分布收集洗脱液，即获得带同种电荷的纯物质 增加洗脱缓冲液的离子强度 1. 洗脱方式 四、洗脱 高浓度的洗脱离子可以和样品物质离子竞争交换剂上的结合位点，增加了洗脱离子置换交换剂上结合的样品离子的反应速度,由于取代反应增强，增加了离子交换剂上溶质离子的释放速度。结合强度取决于样品物质离子的带电量，样品离子的带电量