荧光定量pcr技术李金明.ppt

定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术及其临床应用 卫生部临床检验中心 李金明 PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow] 什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR及有关技术的发展历史（1） 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 PCR发明过程的简单回顾 PCR及有关技术的发展历史（2） 1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim) PCR及有关技术的发展历史（3） 1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断 。 PCR及有关技术的发展历史（4） 1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。 第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。 Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。 1991 TaqMan 技 术 发 表。 当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR专利权。 Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。 耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。 PCR及有关技术的发展历史（5） 1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利； 1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR 标 准试剂盒。 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 PCR及有关技术的发展历史（6） 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查 PCR扩增过程图示 PCR扩增的理论模式 PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n 0≤E≤1 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增. 影响PCR扩增效率的因素: PCR定量的困难? 引物/靶的杂交 反应试剂的相对量 样本在扩增仪中的位置的不同 临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在 PCR扩增模板的量 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低 PCR 和定量问题 定量P