东华理工大学第二章基因工程的酶学基础.ppt

生物技术核心课程 第一章 基因工程概论 第二章　基因工程的酶学基础 第三章　基因工程载体概述 第四章　基因工程的主要技术及原理 第五章 目的基因的克隆与分离 第六章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定 第七章　克隆基因的表达 第八章　基因工程的应用 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶 思考题 DNA连接酶的作用特点有哪些？ 大肠杆菌DNA聚合酶I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。 何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？ 举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有的重要用途 生物界自我防御和自我保护的现象。如水母受到攻击时会缩为一团， 变色龙、刺猬的假死、人的自我防御：跑；除虫菊分泌的粘液、茴香、茼蒿的气味虫子不喜欢、仙人掌等、 微生物分泌色素毒素抗生素等都体现了植物动物微生物的发育完善的自我防御的能力。 那么在分子水平上就体现在R/Mxitong。 ， 第四节 DNA修饰酶 一、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 1. TdT的基本特性 ② 不需要模板！ ① 需要3’-OH、二甲胂酸缓冲液。 5’?3’DNA聚合酶活性（逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子3’-OH末端） ④ 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs ③ 底物可以是：单链DNA 3’-OH突出的双链DNA 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以 DNA 5’ 3’ TTT dTTP ，末端转移酶 2. 末端转移酶的用途 （1）同聚物加尾克隆DNA片段 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 外源DNA 载体DNA 5’ 3’ 5’ 3’ CCC CCC GGG GGG dGTP dCTP 末端转移酶 （2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。 AAGCTT TTCGAA 5’ 5’ HindⅢ酶切 A TTCGA AGCTT A Klenow补平 AAGCT TTCGA AGCTT TCGAA AAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA 末端转移酶 AAA AAA 外源DNA （3）标记DNA片断的3’端 AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA AAA AAA HindⅢ位点 HindⅢ位点 连接 具有放射性同位素32P的dNTP、ddNTP为底物 非放射性标记物：生物素-11-dUTP等 二、T4多核苷酸激酶 1. 来源 T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA、RNA的5’-OH端。使已脱磷酸化的5’末端重新磷酸化。 3. 多核苷酸激酶的用途 催化5’-OH末端磷酸化，便于DNA分子连接； 标记DNA或RNA的5’端 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP 多核苷酸激酶 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 碱性磷酸酶 （1）正向反应（forward reaction） （2）交换反应（exchange reaction） 反应混合物中具有超量ADP和(?-32P)ATP时，多核苷酸激酶能催化(?-32P)ATP的?-32P与DNA5’端的磷酸交换。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP、ADP 多核苷酸激酶 效率低于正向反应，反应效果不理想 三、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离，具有抗热性 Bacterial alkaline phosphatase，BAP （1）细菌性碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化，比活性比BAP高10~20倍 加热70℃，10min可完全失活 2. 碱性磷酸酶的特性 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸基团。 3’ P- -OH