基因工程上下游技术.pptVIP

基因工程上、下游技术 定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。 基因工程药物制造的一般流程： （1）获得目的基因；（2） 组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装 1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的(1)、(2)、(3)步骤属于上游阶段，在实验室完成。 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述(4)、(5)、(6)、(7)、(8)属于下游阶段。 一：基因工程技术主要内容 获得具有遗传信息的目的基因 选择基因载体获得重组DNA 将重组DNA分子导入宿主细胞 鉴定带有目的基因的克隆 目的基因的扩增及获得目的产物 1、获得具有遗传信息的目的基因 1 鸟枪克隆法 2 人工合成目的基因 酶促方法 化学合成法 聚合酶链反应 (PCR) 2 选择基因载体获得重组DNA 在体外将含目的基因的 DNA 片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接 , 获得重组 DNA 分子。可以作为载体的主要有质粒、噬菌体 (phage) 、黏粒 (cosmid) 、病毒载体等。 3 将重组DNA分子导入宿主细胞 采用特定的方法将重组 DNA 分子转移至适当受体细胞 (也称寄主细胞), 并与之同步增殖。被导入的受体细胞分为两大类：第一类为原核细胞,目前常用的有大肠杆菌、枯草芽 抱杆菌、链霉茵等。第二类为真核细胞 , 其中真核微生物主要有酵母、丝状真菌等 , 此外为动物细胞、植物细胞。另外也可以导人动物和植物体。 导人的方法主要有转化、转染等方法 , 此外也可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。 4 鉴定带有目的基因的克隆 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞。为了挑选出重组子,针对不同基因的表达产物,采用各自特有的测活方法确定其生物活性;也可以采用酶联免疫方法确定其抗原性;以目的基因为探针,通过DNA杂交方法可以直接确定重组子。 5 目的基因的扩增及获得目的产物 培养克隆有目的基因的重组子,提取获得扩增的目的基因以进行深入的研究。将目的基因克隆至适当的表达载体,采用特定的方法将基因导入受体细胞,使其在新的遗传背景下获得活性表达,从而得到人类需要的特定目的物质。 二：基因工程上游技术的主要内容 1 聚合酶链反应 2 DNA的序列测定 3 基因文库的构建 1 聚合酶链反应 聚合酶链反应即PCR (polymerase chain reaction) 技术,1983年由美国Mullis发明,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,该技术的发明对分子生物学发展起到极大的推动作用,发明者获得了1993年度诺贝尔化学奖。 1.1 PCR技术的基本原理 DNA是双螺旋分子,在高温条件下双链会发生分离成为单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA分子为模板,在与待扩增DNA片段两端序列互补人工合成的引物及4种脱氧核苷三磷酸的存在条件下,合成新的DNA互补链,该链的起点取决于一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点。两条DNA单链均可成为合成新互补链的模板,鉴于引物是依扩增段两端序列互补原则设计的,因此每一条新生链的合成均起始于引物的退火位点,继而沿相反链延伸,因此每条新合成DNA链均具有新的引物结合位点。当再度加热高温条件下,使新旧DNA双链分开,重复下一轮的循环反应,经过多次循环后反应体系中双链DNA分子数,即一对引物结合位点间DNA片段的拷贝数理论上可达2n 。 PCR反应主要分为3个部分进行 (1)模板变性 (2)退火 (3)延伸 上述3个步骤构成一个循环,每一循环的产物将成为下一循环扩增的模板 解释：双链DNA在90～95℃变性；再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上；然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 下面是一个参考程序循环：预变性 94℃ 4分钟，循环1次(1) 变性94℃ 1分钟??? (2)退火54℃ 1分钟? 延伸 72℃ 1分钟循环30次(3)终延伸 72℃ 7分钟循环1次 1.2