基因工程操作的工具酶zx.ppt

限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。 Ⅰ型限制酶（无用） 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5’一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。 Ⅱ型限制酶（十分有用） 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万～10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。 Ⅲ型限制酶（无用） 组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。 R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。 限制酶的命名 ?6 个碱基识别位点： 　　EcoRⅠ G↓AATTC?　HindⅢ 　 ?A↓AGCTT ?7 个碱基识别位点： 　　　BbvCⅠ ?CC↓TCAGC? 　　　PpuMⅠ ?RG↓GWCCY ?8 个碱基识别位点： 　　　NotⅠ GC↓GGCCGC ?　　　SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 　　 当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。 抑制星星活性的措施： 　　如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到 100～150mM （如果不会抑制酶的活性的话），降低反应 pH 至 pH7.0 ，以及保证使用 Mg2+作为二价阳离子。 二硫苏糖醇(DTT)或β—巯基乙醇： 　　维持酶活性的稳定。 Tris-HCl或Tris-Ac： 　　维持酶活性适合的PH环境。 限制性核酸内切酶的Star活性 几乎所有的限制酶都具有Star活性。 Star活性的影响：导致切割中出现非特异性DNA片段，甚至不能获得预计的DNA片段，影响进一步的DNA连接重组。 排除方法：如降低反应系统中甘油含量，控制pH中性和高盐浓度下进行反应。 ?用途： PCR 反应。 测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。 　　可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA 杂交双链中的单链切口。 　　反应底物为黏端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。 　　反应系统中必须加有辅助因子ATP　　 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ 5′ 5′ (1) AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ (a)分子间连接 (b)分子内连接 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ AT G C T A TA G C T A T4连接酶 T4连接酶 (2) (1) (2) 噬菌体T4DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。 大肠杆菌 DNA 连接酶 　　大肠杆菌DNA连接酶的相对分子量为75KD，对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。 DNA连接酶的主要功能： 就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 基因工程中不常用 　　大肠杆菌DNA连接酶，只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子。 　　反应系统中必须含