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外源基因表达产物的纯化 生物与食品工程学院 外源基因表达产物的分离 外源基因表达产物的分离与纯化是进一步开展其功能研究和应用开发的重要环节。每个生物细胞往往都含有大量不同结构和功能的蛋白质及DNA、RNA、多糖和脂类等众多的非蛋白质，要将目标蛋白从如此众多的物质中分离出来而又要保证其结构与功能的完整性，是一件精细、复杂，而又十分重要的工作。 不同表达形式采取不同的策略 分泌型重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理 包涵体重组蛋白，应先离心回收包涵体 融合型重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 分离纯化常用的方法 超滤 分子大小、性状 离心 密度 层析 带电特性、吸附性、分子大小等 电泳 带电特性、分子大小 盐析 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析 盐析原理： 高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水，破坏蛋白质分子表面的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。 透析法 透析袋 只用于除盐类和小分子杂质 超滤 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质留在膜的一边 膜有各种不同的类型和规格 优点：操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，实验条件温和 离心 原理：当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒下沉或上浮 离心就是利用离心机转子高速旋转产生的离心力，加快沉降速度，把样品中不同沉降系数的物质分离开 微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关 电泳 层析 利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的。 系统的组成: 固定相 流动相 待分离的样品 层析 层析的种类 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 凝胶层析---分子筛层析 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，所以大分子物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，迁移速度慢。 凝胶层析---分子筛层析 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 离子交换层析 原理：离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用，电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力 离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态 洗脱时，通过改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH + - 蛋 白 质 净 电 荷 等电点 吸附阴离子交换剂 吸附阳离子交换剂 pH pI（+） pH = pI（0） pH pI（-） 离子交换层析的基本操作 离子交换层析操作步骤 层析柱平衡 平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要 离子交换层析操作步骤 上样: 为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高 交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数 离子交换层析操作步骤 洗脱 恒定洗过 阶段洗脱 梯度洗脱 离子交换层析操作步骤 产品收集 根据洗脱的方式采取合适的收集方式 亲和层析 将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质直接流出。 选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 亲和层析 生物分子中有些分子的特定结构能同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。 亲和层析 非特异性洗脱: 改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数、温度 特异性洗脱： 再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白 再生：亲和层析拄可在一次层析后用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。 亲和层析 优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点： 1.针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤 Thank You