电泳分子生物学研究方法1.pptVIP

样品、试剂和材料等的保存 温度控制系统--冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0C 恒温培养箱 细菌平板的培养 恒温空气摇床菌体的培养 灭菌器 PCR 仪 恒温水浴及微量加热器 电泳槽 电 泳 仪 凝胶成像系统电泳结果的定性和定量分析 台式高速冷冻离心机 样品的分离 分光光度计 超净工作台提供洁净工作环境 电子天平 pH 计精确的pH值测定 移 液 器液体试剂的精确取量 实验规范训练－仪器的操作 要求：仪器在未经培训前，不得擅自使用 严格按操作规程使用仪器， 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作 违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担 实验规范训练－量程的选择 天平 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格 量程的选择－移液器 2. 工 具 酶 工 具 酶 2.1 工 具 酶—限制性内切酶 特异地识别和结合于一段特殊的DNA序列（二元对称） 多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸，少数识别更长的核苷酸序列 切割双链DNA 切割后形成平端或粘端 BamHⅠ ↓ 5’NNGGATCCNN3’ 3’NNCCTAGGNN5’ ↑ 2.3 工 具 酶— DNA聚合酶 核酸的凝胶电泳 分类 自然胶电泳 变性胶电泳 等电聚焦 梯度胶电泳 印迹转移电泳 双向电泳 浓缩效应 电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成 Cl－的快速泳动在其后面形成低电导，高电压梯度区带动Pr－和Gly－快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr浓缩成狭小薄层 电荷效应、凝胶的分子筛效应 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS) SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物 由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷 SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 SDS中，SDS－蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关 用途：亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等 实验流程 细胞破碎 加入15 mL匀浆液，重悬菌体 超声破碎： 输出功率800w 超声 2秒 间隔10秒 超声次数：30次 4℃ 15,000rpm离心30min 留取上清 酶活性分析 mRNA差异显示 Differential display PCR,DD-PCR 通过比较来自不同样品的mRNA的cDNA片段的电泳带谱，直观、快捷地鉴 别出特异表达基因的cDNA片段，乃至最终克隆出特异表达基因 不同发育阶段特异表达基因的分析 不同环境下基因的特异表达 病理状态下基因的特异表达 分类 反转录酶（reverse transcriptase） RNA依赖的DNA聚合酶 禽源反转录酶来自鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV): ，最佳反应温度420C,具有较高的RAaseH的活性，合成的cDNA较短 鼠源反转录酶:来自鼠白血病病毒莫勒尼株（Mo-MLV）RNaseH活性相对较弱，但最适反应温度为370C，对于具有高度二级结构的模板效率低 三、RNA的电泳检测 1％变性琼脂糖胶 称取0.2g琼脂糖，加入DEPC水12.6mL，5×电泳缓冲液4mL，加热使溶解。 稍冷却（60－65℃）加入37％甲醛3.4mL和4μL GelStar混匀，室温凝固30分钟(通风橱操作) 样品的处理 2μL甲醛 + 1μL样品缓冲液 ＋ 5μL样品，85℃温浴10min，冰浴10min 50V恒压电泳 五、RNA中微量DNA的去除 选取质量和纯度都较好的RNA样品（R值1.8，电泳无降解） 反应体系50uL 10X缓冲液 5 uL RNase抑制剂 0.5 uL（20U） 总RNA 35 uL 无RNase的DNase 8 uL （40U） 37℃,30min 加入等体积的酚：氯仿（3：1），振荡混匀以破坏DNA酶，12000rpm离心2min 水相加入5uL3M乙酸钠pH5.2，200uL无水乙醇，-20℃30min，12000rpm离心10min 用500uL70％乙醇洗沉淀