62008年04医检流式细胞术2008314.pptVIP

第二十三章 流式细胞术 温州医学院检验医学院 临床免疫学检验教研室 目的要求 掌握：流式细胞仪分析和分选原理、数据的显示与分析，流式细胞仪免疫分析 熟悉：流式细胞仪在免疫学中的应用 了解：流式细胞仪的组成及在免疫分析的质量控制 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是一种能精确、快速地对生物细胞的理化特性和生物学特性进行多参数定量分析，并对特定细胞群体分选的新技术。 EPICS XL 流式细胞分析仪 第一节 流式细胞仪的原理 基本结构 细胞流动室及其液流驱动系统； 激发光及其光束成形系统； 细胞信号检测与分析、显示、记录系统. 流式细胞仪是一种在计算机技术支持下高度自动化的显微荧光脉冲分光光度仪，可分为三个部分： （1）细胞流动室及其液流驱动系统：标记了特异性荧光染料的细胞样品和包裹在外的鞘液（NS or PBS）在气体正压的驱动下一起流经流动室，其中的细胞一个一个排列成单行，逐个以相同的速度、相同的轨迹通过检测区，此为流式细胞仪的单细胞流技术； （2）激发光及其光束成形系统：流式细胞仪的激发光大多采用氩离子气体激光器488nm谱线，也可采用半导体激光器。仪器中一般都采用两块相互垂直放置的柱面透镜组成光束成形系统，对激光束进行适当的聚焦，形成截面为椭圆形的照射光斑即检测区。椭圆形光斑的检测区能保证样品中细胞是一个一个分别受到光照，并且每一受检细胞都受到一致的光照激发，此为流式细胞仪中的单细胞照明技术； （3）细胞信号检测与分析处理系统：细胞受到激发光照射时，产生散射光和荧光信号。光电倍增管及其电子线路将每一细胞的光信号转换为相应的电信号，后者再通过模数转换器( ADC )量化为数字信号，由计算机采集、分析、显示与存贮等，此为流式细胞仪的单细胞检测技术。 二、细胞散射光测定 前向散射光(FS) （0.5°~10°检测） 侧向散射光(SS) （90°检测） 荧光信号的放大测定 线性放大器：测定细胞RNA、DNA和总蛋白含量 对数放大器：测定细胞膜表面抗原 四、细胞分选(Cell Sorting)的原理 细胞的分选是指从细胞群体中将选定的细胞分离出来，是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现的。 染色：荧光染料与细胞成分的结合过程 方法： 间接免疫荧光标记 ：信号放大作用，非特异干扰信号较强。 直接免疫荧光标记 ：常用细胞表面标志的染色分析。 三、质量控制 适当的制备方式 溶血剂处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度25~37℃，pH7.0~7.2 染色后尽量洗净细胞外的多余染料，减少荧光本底 温度：低温环境，减少标本的光照射时间 pH：保持荧光抗体的最合适pH值 合适的荧光抗体浓度 细胞固定剂：固定剂 1%～4%多聚甲醛（ pH7.4） 或0.37% ～1.5%甲醛（ pH7.4） 细胞自发荧光：细胞内吡啶、黄素类核苷酸 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 开展室内、室间质控评价 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 红系细胞表面：运铁蛋白受体HLe-1和Glycophorin A 髓系细胞表面抗原CD33，CD13，CD14等； 巨核细胞系膜抗原CD41，CD42，CD61等； B淋巴细胞系膜抗原CD10，CD19，CD20，CD22，HLA-DR等； T淋巴细胞系膜抗原CD2，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8等。 四、肿瘤耐药基因分析 思考题 名词解释：流式细胞术（flow cytometry，FCM）， 细胞分选(cell sorting)，荧光补偿技术 简述流式细胞仪的工作原理。 简述细胞分选的原理。 论述流式细胞术在免疫学中的应用。 FCM多参数测量一般采用List Mode的数据存贮方式 参数：FS SS 荧光(FL) 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、等高线图 、假三维等高图 、三参数散点图 、多参数分析） 第二节 数据的显示与分析 单参数测量数据显示方式：