62011第七讲噬菌体载体99周五.pptVIP

子代噬菌体感染邻近的细胞，这样不断地侵染，最后形成一个圆形的透明区—噬菌斑。一个噬菌斑通常含有107-108个噬菌体。一个噬菌斑是由一个噬菌体引起的，所以，一个噬菌斑中的噬菌体在遗传上是均一的，相当于一个克隆。 采用柯斯质粒作载体的困难 ①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接； ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。 (六)其他载体 　酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒） 人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要载体 YAC载体 3.噬菌体的溶源生命周期 溶源生长周期： 是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期 溶源周期的主要特征：以λ噬菌体为例 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶， 于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌 染色体的一部分进行复制。 5、溶源细菌自发裂解和诱发裂解：在溶源细菌中极少数 （约10-6）会发生原噬菌体大量复制、成熟，导致寄主 细胞裂解，这种现象称为溶源细菌的自发裂解 λ phage 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends) 溶菌阶段 (复制和释放) 溶源阶段 (整合到寄主染色体上) (二)λ噬菌体载体 λ噬菌体载体的主要类型 1. 插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点 的派生载体。 2. 替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 3. 凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型 的，如Charon30。在基因操作中用途很广 1.插入式载体： λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 cI基因插入失活：如λ gt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。 噬菌斑 Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。 cI EcoR I LA 32.7 RA10.6 λgt 10 lac Z LA 19.9 RA21.9 EcoR I Charon 16A 2.λ 替换型载体（取代型载体） 外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段 (~ 20 kb) 高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质粒高100倍以上)