毕赤酵母电转化法及转化子的筛选.docxVIP

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜 (约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240ul；备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入 Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80oC ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。6)20ul ddH2O重溶）电击转化：8. 将5~20 μ g 的线性化DNA 溶解在5~10 μ l TE溶液中，与80 μ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中；9. 将电转化杯冰浴5min；10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板）12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μ l 涂布一块平板；13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。推荐：电压1.5kV ；电容25μF ；电阻200 Ω。电击时间为4 ～10msec。Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。3. 用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，利用5’AOX 1和3’AOX 1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组，则会扩增到两条带，一条为2.2kb（KM71为3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。)Each 50 μl aliquot of competent Pichia cells with 3 μg linearized plasmid DNA will yield 50 colonies on selective medium.Muts表型重组酵母的诱导表达实验As a general rule when inducing expression, never allow cultures to be more than 10-30% of your total flask volume.1. 挑选一单菌落，置于装有50ml MGY、BMG 或BMGY培养基的500ml 摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm 培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；2. 室温下1500~3000g 离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM, BMM或 BMMY重悬菌体（约2