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第二章 基因工程制药 第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例 一、基因的概念: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 ①基因可自我复制 ②基因决定蛋白质结构 ③基因可突变 基因按功能分为 ①结构基因；②调控基因 四、 DNA的复制与表达 （一）DNA的复制 　　半保留复制 （二）基因表达 基因工程基本过程 ●利用基因工程技术生产药品的优点： （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； （4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 第二节 基因工程药物生产的基本过程 目的基因的克隆 构建DNA重组体 将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌 工程菌的发酵 外源基因表达产物的分离纯化 产品检验等。 基因工程药物制备的一般过程 第三节 目的基因的获得 问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？ 对于真核细胞来源的目的基因，不能直接进行分离。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，多拷贝基因也极少，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。 另外，原核表达系统有局限性，缺乏mRNA的转录后加工。 为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 cDNA克隆示意图 1、mRNA的纯化 a. 细胞内RNA的组成和含量: DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% b. 真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT) 在真核细胞中mRNA的3‘末端常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸，可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。 洗脱方法：是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。 2、cDNA第一链的合成 一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在反转录酶的催化下，合成cDNA链。 3、cDNA第二链的合成 先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。 由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。 此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。 4、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如?gt10、 ?gt11等）。 根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。 pUC及?gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及?gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有