鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法.pdf

淡水渔业，2017，47 (1)：61—65 2017年 1月 FreshwaterFisheries Jan．2017 鲤疱疹病毒 II型 ORF4基 因的克隆、表达与 免疫学检测方法 周 勇，范玉顶，徐 进，马 杰，江 南，刘文枝，曾令兵 (中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223) 摘要：根据鲤疱疹病毒 II型(CyprinidherpesvirusII，CyHV一2)ORF4基因序列(GenBank：JQ815364．1)设计特异性 引物 ，PCR扩增得到ORF4基因编码框全长序列 104lbp，将其克隆至原核表达载体pET一32a(+)中，构建了 重组原核表达载体pET一32a—ORF4。将 pET一32a—ORF4重组载体转化大肠杆菌 BL21(DE3)，经 IPTG诱导得 到融合表达的重组蛋 白，融合表达的重组蛋 白主要 以包涵体的形式存在 ，其分子质量约为57ku，与预期大小一 致。将纯化的重组蛋白免疫 日本大耳兔，制备了多克隆抗体 ，ELISA检测抗体效价大于 1：50000，Westernblot 检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。问接免疫荧光检测结果表明：该多克隆抗体可与由CyHV一2感染引 起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞 (GICB)发生特异性的结合。 关键词：鲤疱疹病毒 II型；ORF4；原核表达 ；多克隆抗体 ；免疫荧光检测 中图分类号：$941．41 文献标识码：A 文章编号：1000-6907一(2017)01-0061-05 Cloning，expressionandimmunologicalassayofORF4 encoding proteinofCyprinidherpesvirusII ZHOU Yong，FAN Yu-ding，XUJin，MAJie，JIANGNan，LIUWen—zhi，ZENGLing—bing (YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223，China) Abstract：ThespecificprimerpairsweredesignedaccordingtotheORF4genesequenceofCyprinidherpesvirusII(Cy— HV一2)andthe1401bpfull—lenOhsequenceofORF4genecodingfamewasamplifiedbyPCR，andthenthefull— lenOhCyHV一2ORF4genewasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET一32a(+)toconstructtherecombinantex— pressionvectorpET一32a—ORF4．TherecombinantexpressionvectorpET一32a—ORF4wassuccessfullyexpressedin EcoliBL21(DE3)asafusionproteinwithasizeof57kuafterinductionbyisopropyl—B—D—thiogalactoside(IPTG)． Therecombinantproteinwaspresentedmainlyininclusionbody．Thepurifiedrecombinantproteinswereusedtoimmune Japanesewhiterabbittoproducepolyclonal antibody．Titerofpolyclonalantibodieswasabove1：50000．Western blottest demonstratedthattherecombi